摘要
目的 血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)是血管壁的主要组成成分，它们的异常增殖和迁移是血管损伤后再狭窄、移植物动脉硬化、动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的重要细胞学基础。转化生长因子β激活激酶1(TAK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可以被生长因子和细胞因子等激活，参与调控细胞分化、增殖和迁移等多种生物学功能。本研究旨在探讨TAK1在血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及其分子机制。 方法 1.采用组织贴壁法体外分离培养原代大鼠血管平滑肌细胞，予以重组PDGF-BB进行诱导处理。利用WesternBlot分析检测TAK1的蛋白表达及磷酸化水平，用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测TAK1的mRNA水平。 2.用小干扰RNA(siRNA)敲低TAK1基因表达，或用TAK1抑制剂5Z-7-Oxozeaenol预处理血管平滑肌细胞，随后用PDGF-BB诱导处理。 (1)用CCK-8实验检测细胞活性，用EdU增殖分析检测细胞DNA合成情况，用WesternBlot分析检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平，用Transwell和划痕实验检测细胞的迁移能力。 (2)用流式细胞术检测细胞周期分布，用WesternBlot分析检测周期相关蛋白CyclinD1、CyclinE1、CDK2和CDK4的表达水平，并检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3B及p62的蛋白水平，用免疫荧光染色检测LC3B蛋白的表达水平及细胞内分布情况。 3.用自噬抑制剂3-Methyladenine(3-MA)或Spautin-1分别预处理血管平滑肌细胞，经PGDF-BB诱导处理后，用CCK-8实验检测细胞活性，用划痕实验检测细胞迁移能力，用WesternBlot分析检测前述周期相关蛋白以及PCNA的蛋白表达水平。 4.用5Z-7-Oxozeaenol和/或Spautin-1预处理血管平滑肌细胞，经PGDF-BB诱导处理后,用WesternBlot分析检测PCNA及自噬相关蛋白的表达水平。 结果 在血管平滑肌细胞，PDGF-BB可以上调TAK1的mRNA及蛋白表达，诱导TAK1的磷酸化激活，并能显著促进细胞增殖和迁移。用TAK1-siRNA敲低TAK1基因表达，或用5Z-7-Oxozeaenol抑制TAK1活性，均能有效抑制PDGF-BB诱导的细胞DNA合成及PCNA表达增加，并伴随有细胞增殖和迁移能力明显减弱。进一步分析显示，PDGF-BB通过活化TAK1上调细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinE1、CDK2和CDK4的蛋白表达，诱导血管平滑肌细胞周期从G1期进入S期。 此外，TAK1介导PDGF-BB激活细胞自噬，表现为细胞自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的蛋白水平上调，而p62的蛋白含量降低。用3-MA或Spautin-1预处理血管平滑肌细胞抑制细胞自噬后，能有效阻断PDGF-BB诱导的细胞周期相关蛋白及PCNA蛋白表达上调，显著抑制细胞增殖和迁移。并且，在PDGF-BB处理的血管平滑肌细胞中，TAK1抑制剂5Z-7-Oxozeaenol和自噬抑制剂Spautin-1都能引起程度相当的细胞增殖抑制效应，但Spautin-1并不能进一步增强5Z-7-Oxozeaenol的细胞增殖抑制效应，结果提示PDGF-BB通过活化TAK1/细胞自噬信号通路促进血管平滑肌细胞增殖和迁移。 结论 PDGF-BB通过上调TAK1的蛋白表达和活化诱导血管平滑肌细胞自噬，从而促进细胞增殖和迁移。研究结果表明，TAK1可能是血管增殖性疾病的有效治疗靶点。
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