摘要
目的：从“脾虚致消”的理论入手，通过饮片、组分、单体多个层次研究黄芪、葛根及其配伍对糖尿病脂肪组织脂肪因子与AMPK通路转导的调控作用，明确黄芪、葛根及其配伍调节糖尿病糖脂代谢的作用机制与有效物质。 材料与方法： 第一部分：文献研究 通过整理古籍与现代文献，从消渴病因、病机、治疗方面论述脾与消渴的关系；通过膏脂的病因、病机与治疗论述脾与膏脂的关系。 第二部分：实验研究 实验一： 86只SPF级雄性SD大鼠随机分为6组，分别为正常组、模型组、金芪降糖片组、黄芪组、葛根组、饮片配伍组，正常组11只，其余各组15只。除正常组外，一次性腹腔注射2%STZ(46mg/kg)造模，造模同日给药，正常组、模型组分别予蒸馏水10mL/kg，其他给药组分别予金芪降糖片混悬液1.47g/kg、黄芪2.7g/kg、葛根1.35g/kg、黄芪葛根汤4.05g/kg，连续灌胃30d。生化法检测血糖、TG、CHO含量，ELISA法检测APN、LEP、TNF-α、GLUT-4含量，Real-timePCR法检测Chemerin、ChemR23、AMPK、GLUT-4、β-actinmRNA相对表达量。 实验二： 146只SPF级雄性SD大鼠随机分为10组，分别为正常组、模型组、金芪降糖片组、黄芪黄酮组、黄芪皂苷组、葛根黄酮组、黄芪黄酮+黄芪皂苷组、黄芪黄酮+葛根黄酮组、黄芪皂苷+葛根黄酮组、黄芪黄酮+黄芪皂苷+葛根黄酮组，正常组11只，其余各组15只。除正常组外，其余各组一次性腹腔注射2%STZ(46 mg/kg)造模，造模同日给药，正常组、模型组分别予蒸馏水10mL/kg，其他给药组分别予金芪降糖片混悬液1.47g/kg、黄芪黄酮0.039g/kg、黄芪皂苷0.104g/kg、葛根黄酮0.036g/kg、黄芪黄酮+黄芪皂苷0.143g/kg、黄芪黄酮+葛根黄酮0.075g/kg、黄芪皂苷+葛根黄酮0.140g/kg、黄芪黄酮+黄芪皂苷+葛根黄酮0.179g/kg，连续灌胃30d。生化法检测血糖、TG、CHO含量，ELISA法检测APN、LEP、TNF-α、GLUT-4含量，Real-timePCR法检测Chemerin、ChemR23、AMPK、GLUT-4、β-actinmRNA相对表达量。 实验三： 3T3-L1前脂肪细胞分别予50μM、100μM、200μM、400μM毛蕊异黄酮葡萄糖苷(简称：毛蕊异黄酮苷)完全培养基，0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM葛根素完全培养基培养24h、48h、72h，MTT法检测细胞存活率，筛选出最适的给药时间与给药浓度。将筛选出的毛蕊异黄酮苷100μM、200μM、400μM与葛根素2μM、4μM一一配伍，培养3T3-L1前脂肪细胞48h。MTT法检测细胞存活率，筛选出最适的给药浓度。3T3-L1前脂肪细胞分为5组，正常组全程予完全培养基，模型组予完全培养基，毛蕊异黄酮苷组予200μM毛蕊异黄酮苷，葛根素组予4μM葛根素，单体配伍组予200μM毛蕊异黄酮苷+4μM葛根素，培养48h。模型组予诱导液A(1μg/mLIBMX、1μMDEX、1μg/mLINS+完全培养基)、其余各组分别予治疗药物+诱导液A，培养48h。模型组予诱导液B(1μg/mLINS+完全培养基)、其余各组分别予治疗药物+诱导液B，培养48h，换液2次。油红O检测脂肪细胞分化成脂，ELISA法检测TG、CHO、APN、LEP、TNF-α含量，流式细胞术检测2-NBDG含量，免疫荧光法检测GLUT-4，WesternBlot法检测AMPK、P-AMPK、β-actin含量。 结果： 第一部分：文献研究 1.脾与消渴的关系： 消渴的病因与脾虚有关，其病机多与脾气虚不能布散津液、脾阴不足有关。消渴的治疗可从脾入手，选用益气健脾的方药。 2.脾与膏脂的关系： 现代解剖的脂肪、肌肉皆属于中医“肌肉”范畴，统归于脾。膏脂的形成与饮食五谷壅滞损伤脾胃，脾气虚或脾阳不足，不能输布精微有关，治疗时选用健脾药物。 第二部分：实验研究 体内实验(论文一、二)： 1.对糖尿病大鼠血糖、血脂的影响： (1)对糖尿病大鼠血糖的影响：造模第30d，与正常组比较，模型组大鼠血糖显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮能明显降低糖尿病大鼠血糖，差异有统计学意义(P＜0.05)。 (2)对糖尿病大鼠血脂的影响：与正常组比较，模型组大鼠血清CHO、TG水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够降低糖尿病大鼠血清CHO、TG(黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍除外)含量，差异有统计学意义(P＜0.05)。在饮片层次，黄芪与葛根能够协同降低TG，效果最佳；在组分层次，单用黄芪皂苷降低CHO水平最佳，单用黄芪黄酮降低TG的作用最优。 2.对糖尿病大鼠脂肪因子的影响： (1)对糖尿病大鼠APN、LEP、TNF-α的影响：与正常组比较，模型组大鼠APN、LEP表达明显降低，模型组TNF-α水平明显上高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，黄芪、饮片配伍、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够显著升高糖尿病大鼠脂肪组织APN水平；黄芪、饮片配伍能够提高糖尿病大鼠脂肪组织LEP表达量；黄芪、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够显著降低糖尿病大鼠脂肪组织TNF-α水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在饮片层次，单用黄芪降低TNF-α的效果优于两药合用。在组分层次，黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍协同降低TNF-α水平，效果最佳。 (2)对糖尿病大鼠Chemerin、ChemR23mRNA的影响：与正常组比较，模型组大鼠Chemerin、ChemR23mRNA相对表达量明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，黄芪、葛根、黄芪黄酮、黄芪皂苷、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍能够减少糖尿病大鼠脂肪组织ChemerinmRNA相对表达量；黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够降低糖尿病大鼠脂肪组织ChemR23mRNA相对表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在饮片层次，单用黄芪降低ChemR23mRNA相对表达量的效果最佳。在组分层次，单用黄芪黄酮降低糖尿病大鼠脂肪组织Chemerin、ChemR23mRNA相对表达量的效果最佳。 3.对糖尿病大鼠AMPK、GLUT-4的影响 (1)对糖尿病大鼠AMPK、GLUT-4mRNA的影响：与正常组比较，模型组大鼠AMPK、GLUT-4mRNA水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，黄芪、葛根、单体配伍、黄芪黄酮、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够升高糖尿病大鼠AMPKmRNA水平；黄芪、葛根、饮片配伍、黄芪黄酮、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能够升高糖尿病大鼠GLUT-4mRNA水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在饮片层次，黄芪与葛根能够协同增加GLUT-4mRNA，效果最佳。在组分层次，单用黄芪黄酮增加糖尿病大鼠脂肪组织AMPK、GLUT-4mRNA相对表达量的效果最好。 (2)对糖尿病大鼠GLUT-4含量的影响：与正常组比较，模型组大鼠GLUT-4水平明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，黄芪、单体配伍、黄芪黄酮、黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、黄芪皂苷与葛根黄酮配伍、黄芪黄酮、黄芪皂苷、葛根黄酮三者配伍能升高糖尿病大鼠脂肪组织GLUT-4水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。在饮片层次，黄芪黄酮与黄芪皂苷配伍增加糖尿病大鼠脂肪组织GLUT-4水平的效果最佳。 体外实验： 1.对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响： (1)对3T3-L1前脂肪细胞成活率的影响：培养48h，100μM、200μM、400μM毛蕊异黄酮苷促进3T3-L1前脂肪细胞增殖的效果佳；2μM、4μM葛根素能够促进3T3-L1前脂肪细胞增殖；200μM毛蕊异黄酮苷与4μM葛根素合用能够促进3T3-L1前脂肪细胞增殖。 (2)对3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响：显微镜下观察，毛蕊异黄酮苷组、葛根素组、单体配伍组内可见有大量的成熟脂肪细胞，数量较正常组和模型组明显增多。油红O吸光度结果显示，与正常组比较，模型组没有统计学差异(P≥0.05)。与模型组比较，毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能显著升高油红的吸光度，差异具有统计学意义(P＜0.05)，毛蕊异黄酮苷与葛根素能够协同促进脂肪细胞形成，效果最佳。 2.对IR脂肪细胞糖、脂的影响： (1)对IR脂肪细胞摄取2-NBDG的影响：与正常组比较，模型组细胞内2-NBDG的含量减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，毛蕊异黄酮苷、单体配伍能够显著提升IR脂肪细胞内2-NBDG的含量，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 (2)对IR脂肪细胞CHO、TG的影响：与正常组比较，模型组细胞内CHO、TG水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能够显著降低IR模型脂肪细胞的CHO、TG水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3.对IR脂肪细胞脂肪因子的影响：与正常组比较，模型组细胞内APN、LEP水平显著降低，模型组TNF-α水平升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能够显著升高IR模型脂肪细胞APN、LEP水平，降低TNF-α水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。毛蕊异黄酮苷、葛根素能够协同增加APN、LEP水平，协同降低TNF-α水平，效果最佳。 4.对IR脂肪细胞AMPK、GLUT-4的影响： (1)对IR脂肪细胞AMPK的影响：与正常组比较，模型组细胞内p-AMPK/AMPK水平显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能够显著升高IR模型脂肪细胞p-AMPK/AMPK水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 (2)对IR脂肪细胞GLUT-4的影响：与正常组比较，模型组细胞内GLUT-4水平明显减少。毛蕊异黄酮苷、葛根素、单体配伍能增加IR模型脂肪细胞的GLUT-4含量。 结论： 1“脾虚”是消渴发病、膏脂形成的主要病机，可从脾论治消渴。 2黄芪黄酮、毛蕊异黄酮苷是黄芪降低血糖、降低血脂(CHO、TG)的有效成分。 3葛根黄酮、葛根素是葛根降血脂(CHO、TG)的有效成分。 4黄芪与葛根配伍、毛蕊异黄酮苷与葛根素配伍能够降低血糖，合用的效果最佳；其降糖的作用机制可能与调节脂肪因子、介导AMPK/GLUT-4转导有关。 5黄芪与葛根配伍、黄芪黄酮与葛根黄酮配伍、毛蕊异黄酮苷与葛根素配伍能够降低CHO、TG，合用降血脂的效果最佳(黄芪黄酮与葛根黄酮配伍除外)；其降脂的作用机制可能与调节脂肪因子、介导AMPK转导有关。
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