摘要
真菌病害和低温是茶树生长发育过程中主要的生物胁迫和非生物胁迫因素，对茶叶品质和产量有重要影响，备受关注。本研究以茶树炭疽病和冻害为研究对象，探索茶树抵御这两种胁迫的分子机制及调控网络，寻找可供分子标记辅助选择（MAS）育种利用的抗性相关分子标记，以期加快茶树的抗性育种进程，实现多基因有效聚合，促进茶树高抗多抗育种，为茶树高质量生产提供基础。 本文以‘龙井43’为主的多个茶树品种为试验对象，采用高通量测序、转录组、双重转录组、基因克隆、高效液相色谱（HPLC）、实时荧光定量（qRT-PCR）、平行反应监测（PRM）、色差分析和叶绿体荧光参数（Fv/Fm）测定等技术，研究茶树炭疽病感病叶的真菌多样性，揭示病原菌种类及致病活力，为活体或者离体实验提供致病菌；建立茶树炭疽菌有伤接种和快速感染的方法，开发茶树炭疽病抗性基因及其分子标记，了解关键基因、蛋白和植物激素的作用，明确茶树和炭疽菌的互作机制；开发茶树多品种抗冻性快速评价体系和相关分子标记，为抗寒育种提供科学依据。主要结果如下： ①真菌多样性结果显示，茶树健康叶中枝孢属Cladosporium、柱隔孢属Ramularia丰度较高，炭疽病发病叶前中期炭疽病菌属Colletotrichum的菌群比例显著上升，发病中后期炭疽病菌属的菌群比例稍有下降，而假拟盘多毛孢属Pseudopestalotiopsis显著增加。炭疽菌属是茶树炭疽病的主要致病菌属，假拟盘多毛孢属菌群在中后期显著增加，与前者共同作用，扩大病斑和形成其它病症。 ②病原菌的分离和纯化结果表明，初代分离菌回接后，对新感染病斑再进行组织分离的方法，相比单一使用组织分离法或者稀释法，杂菌较少，效果最好。本研究分离的9株菌株中有6株是炭疽病菌，分离率67%。分子鉴定结果显示，涉及45种纯化菌株的种类，主要优势致病菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides或其复合种。 ③两个易感病品种（‘龙井43’和‘浙农139’）健康叶和感病叶的转录组分析表明，‘龙井43’叶片检出差异表达基因1621个，‘浙农139’则达到3089个，差异表达基因主要富集在植物激素信号传导和植物-病原体相互作用这两条重要的KEGG代谢通路中，同时涉及氧化还原反应、催化活性、细胞壁变化等GO通路。对ALD1、NPR1和PR1等多个关键基因进行克隆，明确其核苷酸序列，并对其氨基酸序列在线分析，预测其蛋白理化性质和结构模型。HPLC结果显示茶树感染炭疽病后内源性水杨酸含量显著提高，qRT-PCR结果表明感病叶中的ALD1、NPR1和PR1等基因表达显著上调。在茶树上第一次证实PR1蛋白和内源性水杨酸是炭疽病感染过程的关键化合物，它们对茶叶抗炭疽病的免疫激活反应起关键作用，可用于分子标记辅助育种。 ④建立改良的有伤接种和计算机图像识别技术相结合的茶树抗病性判断方法，检测表明：‘LCS’、‘4-52’和‘4-147’属于抗病品种，WM1、WM3和‘FZ-0’属于易感病品种。番红固绿染色法结果表明：茶树品种的抗病性差异可能源于细胞壁变化的快慢和木质素含量的增加量。建立2个茶树品种（‘LCS’和‘WM3’）和5个时间点（0h、12h、30h、72h和120h）和炭疽菌TJB44的具有时间分辨的双重转录组数据库，结果表明：共有7425DEGs参与茶树抵御炭疽病的过程，主要集中在细胞壁相关、次级代谢产物、酶类、植物激素、过氧化物、信号传递、转录因子、PR蛋白等过程，抗病性强的品种可能在感染初期能快速响应炭疽菌入侵信号，通过细胞壁的变化和植保素的产生等对炭疽菌的定植有减缓和阻止作用；共有3697个DEGs参与炭疽菌入侵过程，发现炭疽菌的致病能力与植物毒素（Cerato-ulmin、Cerato-platanin）、果胶裂解酶等破坏茶树细胞壁的酶类、伏鲁宁小体、CAP20蛋白和CFEM效应子等显著相关。PRM蛋白质定量验证结果表明：茶树几丁质酶（CHIT）、类甜蛋白（TLP）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）在72h处理组显著上调，这些酶降解炭疽菌细胞壁成分，与转录组结果一致；‘LCS’健康叶PR1蛋白含量显著高于‘WM3’；处理组该蛋白含量减少，而PR1基因显著上调，可能是PR1蛋白由于在抗病过程中发挥作用而被消耗，消耗量大于合成量。双重数据库揭示了炭疽菌入侵和茶树防御的相关基因及其编码产物，为深入研究茶树和炭疽菌互作分子机制提供基础。 ⑤使用田间观测法测定47个茶树品种的冻害系数（H），有效判断不同茶树品种的抗冻性差异。茶树枝条在-15℃冷冻2h后置于室温5h，其Fv/Fm、psbA基因的表达水平、色差中的绿红（a）指标与不同茶树品种的抗冻性差异相关。研究发现，a指标冷冻前后的比值Ra和Fv/Fm冷冻前后的比值RFv/Fm与H呈现相关性，线性回归方程分别为：H=30.03?10.82Ra（n=47，P值＜0.01）和H=60.31?50.09RFv/Fm（n=47，P值＜0.01）。qRT-PCR结果显示抗冻性强的茶树品种在冷冻胁迫后仍能保持较高的psbA基因表达水平，有利于D1蛋白的从头合成和维持光系统2（PSII）活力。这些指标能快速评价茶树品种抗冻性，有利于加速茶树抗冻能力筛选进程。
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