摘要
禽白血病(Avian Leukosis ,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起对家禽危害较大的一种以垂直及水平方式进行传播的肿瘤性疾病。该病发病率为3%～5%，病程长，严重增加家禽养殖业的损失。目前对于该病没有有效的药物及疫苗。因此，本研究对河北地区AL展开流行病学调查，及主要流行亚群gp85基因进行了原核表达及真核表达，并对其进行了免疫效果的初步研究。研究内容和结果如下： 1.河北地区种鸡ALVp27携带情况、流行亚群及其分子特征分析 本研究通过对河北地区种鸡场采集种蛋和肛拭子样本(共包含6个地区的7个种鸡场3496份样品，其中地方品种2533份、引进品种159份、培育品种804份)，利用p27抗原ELISA试剂盒检测ALVp27携带情况，结果显示2018-2019年河北地区种鸡场的阳性率达85.71%，个体平均阳性率达13.79%，地方品种阳性率达18.91%，引进品种阳性率为1.26%，培育品种阳性率仅为0.12%；采用PCR方法检测2018-2019年主要流行亚群，结果显示J亚群检出率为13.79%，E亚群检出率为13.70%，A亚群检出率为0.09%，K亚群检出率为2.23%；对主要流行亚群ALV-Jgp85基因测序分析，显示分离株与参考株的同源性达98.50%~100.00%，且主要围绕HPRS-103发生变异。 2.ALV-Jgp85原核表达及免疫保护力评价 为克隆出ALVgp85基因，设计引物，构建pET-32a-gp85表达载体，将重组载体转化入BL21大肠杆菌工程菌中，成功表达目的蛋白，蛋白分子质量约54kDa，Westernblot方法表明该蛋白具有良好的免疫原性。将原核表达蛋白以100μg、150μg、200μg/只剂量进行免疫，免疫后第7、14、21、28d采血，通过ELISA方法检测特异性gp85抗体水平，结果显示，免疫各组各期的血清gp85抗体水平均显著高于对照组(P<0.05)，以150μg免疫组的各期抗体水平最高，与100μg、200μg免疫组比较均达显著水平(P<0.05)。第35d天以3TCID50攻毒，利用ELISAp27抗原试剂盒检测其抗原携带情况，进而分析其保护率，结果表明，在攻毒21d时，100μg免疫组保护力最低，150μg免疫组保护力次之，200μg免疫组保护力为26.67%。 3.ALV-Jgp85真核蛋白在293T细胞中的表达及免疫效果评价 为获得293T细胞表达的gp85蛋白，本研究将gp85基因导入表达质粒pEGFP-N1，得到重组质粒pEGFP-N1-gp85，转染293T细胞，经倒置荧光显微镜观察和Westernblot鉴定，获得gp85真核蛋白，分子质量约为60kDa。将pEGFP-N1-gp85真核质粒以100μg、150μg、200μg/只剂量进行免疫，免疫后第7、14、21、28d采血，利用ELISA方法检测特异性gp85抗体水平，利用MTT法检测T淋巴细胞转化率，第35d天以3TCID50攻毒，检测ALVp27抗原携带情况，进而分析其保护率。结果显示，免疫各组各期的血清gp85抗体水平及外周血T淋巴细胞转化率均显著高于对照组(P<0.05)，以150μg免疫组的各期抗体水平最高，与100μg、200μg免疫组比较均达显著水平(P<0.05)。在攻毒试验21d时，100μg免疫组保护力最低，200μg免疫组保护力次之，150μg免疫组保护力为53.33%。表明该真核质粒适宜免疫剂量为150μg。
NETL