摘要
心功能不全已成为全球公共健康问题，其患病率和死亡率逐年攀升。有研究报道，免疫紊乱是心功能不全发生发展的重要因素。根据临床数据显示，约40%-60%心功能不全患者血清中检测到的β1-肾上腺素受体自身抗体(β1-adrenergicreceptorantibody，β1-AA)作为免疫紊乱的产物，可与心肌细胞膜表面的β1-肾上腺素受体(β1-adrenergicreceptor，β1-AR)结合引发心肌细胞的持续性损伤，诱导心肌细胞死亡，导致心功能不全，但具体机制尚不清楚。 我们课题组前期研究表明，β1-AA诱导的心肌自噬流下降参与心功能不全的发生发展。自噬是细胞内保守的降解途径，β1-AA诱导的心肌自噬流下降导致细胞稳态被破坏，诱导心肌细胞死亡参与心功能不全，进一步采用自噬激动剂雷帕霉素上调心肌自噬流，可显著改善β1-AA诱导的心功能不全。因此，上调β1-AA诱导的心肌自噬流下降对改善心功能不全至关重要。雷帕霉素作为经典的上调自噬流的药物，其通过抑制mTOR(mammaliantagert of rapamycin)活性上调自噬，但具有明显的不良反应，例如血小板降低、胰岛素敏感性降低等。因此雷帕霉素的使用存在安全隐患，可见寻找新型安全有效的上调自噬流的药物迫在眉睫。 脂联素与自噬流密切相关，其与细胞膜表面的脂联素受体结合，使AMPK(Adenosine5‘-monophosphate(AMP)-activatedproteinkinase，AMP依赖蛋白激酶)磷酸化进而上调自噬流。脂联素是由脂肪细胞分泌的细胞因子，心肌细胞也有少量分泌，具有广泛的心肌保护作用，可改善动脉粥样硬化，减少心肌梗死面积等。有文献报道，脂联素基因敲除(APN-KO)小鼠心肌自噬流显著下降并存在心功能障碍，那么脂联素对于β1-AA诱导的心肌自噬流下降及心功能不全有何影响目前尚不清楚，我们是否可将脂联素作为上调心肌自噬流及改善心功能不全的潜在治疗手段及其可能的调节机制，仍需进一步验证。 为了探究脂联素对β1-AA诱导的心肌自噬流下降及心功能不全的作用，我们采用β1-AR细胞外第二环抗原肽段(β1-AR-ECII)对APN-KO小鼠和C57BL/6小鼠进行主动免疫，ELISA法检测小鼠血清中β1-AA的OD值明确主动免疫模型是否建立成功。采用Westernblot和Real-timePCR检测主免2w和4w小鼠心肌自噬流，结果表明，脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心肌自噬流下降。进一步采用小动物超声仪检测主免8w和12w小鼠心功能，随后取主免12w各组小鼠的心肌组织，采用Masson染色检测各组小鼠心肌纤维化程度，以上结果显示，脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心功能不全及心肌纤维化。由此可见，脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心肌自噬流下降进而加重心功能不全及心肌纤维化。进一步采用AMPK磷酸化抑制剂CompoundC预处理H9c2心肌细胞，结果表明脂联素不可改善β1-AA诱导的心肌细胞AMPK磷酸化水平下降。同时自噬流检测结果表明脂联素也不可逆转β1-AA诱导的LC3B和Beclin1的mRNA及LC3II蛋白表达的降低，提示脂联素改善β1-AA诱导的自噬小体生成降低依赖AMPK途径。但CompoundC预处理后脂联素仍可改善P62蛋白的累积即仍可增加自噬小体的清除，提示脂联素改善β1-AA诱导的自噬小体的清除降低不依赖AMPK途径。本研究旨在为β1-AA阳性心功能不全患者的防治提供实验基础。 第一部分脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心肌自噬流下降进而加重心功能不全 研究目的： 选取脂联素基因敲除(APN-KO)小鼠和C57BL/6小鼠构建主动免疫模型，检测小鼠心肌自噬流和心功能的变化及心肌纤维化程度，探究脂联素缺乏对β1-AA诱导的心肌自噬流下降及心功能不全的作用。 研究方法： (1)基因鼠类型鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定APN-KO小鼠的基因型； (2)实验分组：Control组(C57BL/6小鼠)，主动免疫组(C57BL/6小鼠、APN-KO小鼠)； (3)采用β1-AR-ECII对6-8w雄性C57BL/6小鼠和APN-KO小鼠进行主动免疫，于主免2w、4w、8w、12w时鼠尾静脉取血，采用ELISA检测血清中β1-AA的OD值；(4)采用Realtime-PCR和Westernblot检测主动免疫2w和4w各组小鼠心肌自噬相关基因和蛋白的变化； (5)采用小动物超声仪检测主动免疫8w和12w各组小鼠的心功能； (6)取主动免疫12w各组小鼠的心肌组织，石蜡包埋后，进行Masson染色，观察心肌纤维化程度。 研究结果： (1)脂联素基因敲除小鼠基因型鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳检测小鼠基因型，确定脂联素基因敲除成功； (2)建立β1-AA主动免疫小鼠模型：随着免疫时间的延长，小鼠血清中β1-AA的OD值显著升高，在2w时即出现统计学差异，表明主动免疫小鼠模型构建成功； (3)脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心肌自噬流下降：主免2w时，与Control组相比，APN-KO主免小鼠心肌自噬流下降，而C57BL/6主免小鼠无显著差异；主免4w时，APN-KO主免小鼠心肌自噬流较C57BL/6主免小鼠进一步下降； (4)脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心功能障碍：主免8w时，与Control组相比，APN-KO主免小鼠的心功能显著下降，但C57BL/6主免小鼠并无差异；主动免疫至12w，APN-KO主免小鼠心功能较C57BL/6主免小鼠进一步下降； (5)脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心肌纤维化：主免12w时，与Control组相比，APN-KO主免小鼠和C57BL/6主免小鼠心肌组织中均出现蓝染区域，且APN-KO主免小鼠的蓝染区域较C57BL/6主免小鼠增加。 结论： 脂联素缺乏加重β1-AA诱导的心肌自噬流下降进而加重心功能不全及心肌纤维化。 第二部分脂联素改善β1-AA诱导的心肌自噬流下降进而减少心肌细胞死亡 研究目的： 采用β1-AR-ECII主动免疫大鼠血清中提纯的β1-AA作用于H9c2心肌细胞，并采用脂联素预处理，观察脂联素是否能改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞存活率下降及自噬流下降。 研究方法： (1)β1-AA抗体的制备：将6-8w雄性SD大鼠按照随机数字表法分为Control组和主动免疫组，每组6只，于主动免疫8w时进行鼠尾静脉取血，采用ELISA检测血清中β1-AA的OD值，随后进行大鼠腹主动脉取血，并采用亲和层析法提纯血清中的β1-AA用于离体实验； (2)细胞分组：Control组(1μmol/l阴性IgG处理细胞24h)；β1-AA组(1μmol/lβ1-AA处理细胞24h)；β1-AA+脂联素组(10ng/ml脂联素预处理细胞1h后加入1μmol/lβ1-AA处理24h)；脂联素组(10ng/ml脂联素处理细胞25h)； (3)采用CCK-8法检测各组心肌细胞存活率； (4)采用Real-timePCR和Westernblot检测心肌细胞中自噬相关基因和蛋白的变化。 研究结果： (1)成功制备具有生物学活性的β1-肾上腺素受体自身抗体：与Control组相比，主免8w大鼠血清中β1-AA的OD值显著升高，采用亲和层析法提纯血清中的β1-AA，用于后续离体实验； (2)脂联素改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞存活率下降：10ng/ml脂联素预处理可显著逆转β1-AA诱导的H9c2心肌细胞存活率下降； (3)脂联素改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞自噬流下降：脂联素预处理可改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞Beclin1、LC3BmRNA及LC3II蛋白表达下降及P62蛋白的累积。 结论： 脂联素预处理可显著改善β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降进而减少心肌细胞死亡。 第三部分脂联素改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞自噬流下降部分依赖AMPK途径 研究目的： 采用AMPK磷酸化抑制剂CompoundC预处理H9c2心肌细胞，从离体水平探究脂联素改善β1-AA诱导心肌细胞自噬流下降的可能机制。 研究方法： (1)实验分组：Control组(1μmol/l阴性IgG处理细胞24h)；β1-AA组(1μmol/lβ1-AA处理细胞24h)；β1-AA+脂联素组(10ng/ml脂联素预处理细胞1h后加入1μmol/lβ1-AA处理24h)；脂联素组(10ng/ml脂联素处理细胞25h)；β1-AA+脂联素+CompoundC组(20μmol/lCompoundC预处理细胞30min后加入10ng/ml脂联素预处理1h，最后加入1μmol/lβ1-AA处理细胞24h)；β1-AA+CompoundC组(20μmol/lCompoundC预处理细胞30min后加入1μmol/lβ1-AA作用24h)； (2)采用Westernblot检测各组心肌细胞AMPK磷酸化水平； (3)采用Real-timePCR和Westernblot检测心肌细胞中自噬相关基因和蛋白的变化。 研究结果： (1)脂联素改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞AMPK磷酸化水平下降：脂联素预处理可显著改善β1-AA诱导的H9c2心肌细胞P-AMPK/AMPK比值下降； (2)脂联素改善β1-AA诱导的心肌细胞自噬小体生成降低依赖AMPK途径：采用AMPK磷酸化抑制剂CompoundC预处理后，脂联素不可改善β1-AA诱导的心肌细胞Beclin1、LC3BmRNA及P-AMPK/AMPK比值、LC3II蛋白的下降； (3)脂联素改善β1-AA诱导的心肌细胞自噬小体清除降低不依赖AMPK途径：采用AMPK磷酸化抑制剂CompoundC预处理后，脂联素仍可改善β1-AA诱导的心肌细胞P62蛋白的累积。 结论： 脂联素改善β1-AA诱导的心肌细胞AMPK磷酸化水平降低，采用CompoundC抑制AMPK磷酸化作用后，脂联素不可改善β1-AA诱导的自噬小体生成降低，但仍可改善β1-AA诱导的自噬小体的清除降低，提示脂联素改善β1-AA诱导的心肌细胞自噬流下降部分依赖AMPK途径。
NETL