摘要
目的：中药何首乌具有补肝肾、益筋骨、乌须发之功效，临床应用十分广泛。但近年来，由何首乌引起的肝损伤实践已经引起医学界广泛重视。本实验通过体外细胞试验筛选出制首乌两个毒性较强部位，采用HPLC分析发现其主要含有的目标成分；对目标成分进行了体内体外毒性评价，在此基础上，利用RT-PCR和蛋白免疫印记技术，探讨对其药物代谢酶CYP1A1和CYP3A4表达的影响，以期为研究何首乌临床合理应用提供依据。 方法：1．以制首乌为研究对象，采用系统溶剂法提取制首乌不同极性的提取物，采用CCK-8法筛选出制首乌两个毒性较强部位。HPLC检测这两个部位中的主要成分，确定其可能致肝损伤成分。 2．通过倒置显微镜观察不同浓度的大黄素、大黄酸、没食子酸对HepG2细胞形态的影响；采用CCK-8法和AnnexinV-FITC/PI双染法测定了不同浓度的大黄素、大黄酸、没食子酸诱导HepG2细胞的凋亡情况；通过RT-PCR技术来研究各组细胞药物代谢酶CYP1A1、CYP3A4以及Caspase-3mRNA的表达情况；并用WB检测了CYP1A1、CYP3A4以及cleavedCaspase-3蛋白表达量，从而研究制首乌不同成分诱导HepG2细胞调亡的机制。 3．取60只KM小鼠，随机分为6组，空白组(0g/(kg?d))、生首乌(8g/(kg?d))、制首乌(8g/(kg?d))、大黄素(37.8mg/(kg?d))、大黄酸(312μg/(kg?d)))、没食子酸(4.58g/(kg?d))(相对于成人最大用量的40倍)，每组10只，连续灌胃4周，取血清检测血液生化指标变化；取肝组织HE染色观察肝组织病理变化；RT-PCR技术捡测各组大鼠肝组织CYP1A1、CYP3A4以及Caspase-3mRNA的表达情况；WB测定何首乌不同成分对肝组织药物代谢酶CYP1A1、CYP3A4以及cleavedCaspase-3蛋白表达的影响，以期进一步探讨何首乌致肝损伤的毒性机制。 结果1．制首乌四个不同极性提取物中二氯甲烷提取部位和乙酸乙酯提取部位对细胞毒性较强；HPLC检测结果显示：二氯甲烷提取部位主要含有：大黄素、二苯乙烯苷；乙酸乙酯提取部位主要含有：没食子酸、大黄酸、大黄素。其中大黄素、大黄酸、没食子酸不同浓度均对细胞产生抑制，而二苯乙烯苷对细胞的抑制不明显。 2．CCK-8和细胞流式仪检测结果显示：大黄素、大黄酸、没食子酸各成分给药组均对HepG2细胞产生了不同程度的损伤，高浓度下出现明显的细胞毒性作用(P＜0.01)。各成分给药组随着浓度升高，Caspase-3mRNA以及cleavedCaspase-3蛋白的表达也显著升高，提示细胞产生异常凋亡。大黄素、大黄酸、没食子酸各成分剂量依赖性诱导CYP1A1、CYP3A4的mRNA及蛋白表达。 3．整体动物实验，用生首乌、制首乌、大黄素、大黄酸、没食子酸分别给小鼠灌胃4周后，制首乌小鼠血清ALT、AST、ALP水平与空白组比较无明显差异，提示小鼠肝细胞无明显损伤；生首乌、大黄素、大黄酸、没食子酸组小鼠血清AST、ALP水平明显升高(P＜0.05)，提示大鼠肝细胞膜被大量破坏，肝功能出现了明显的异常；肝组织病理结果显示：生首乌组、大黄酸组、大黄素组以及没食子酸组肝细胞出现了不同程度的疏松、淡染，门管区可见局灶性坏死，从肝损伤程度来看大致为没食子酸＞大黄酸组＞大黄素组＞生首乌组＞制首乌组；生首乌组、大黄酸、没食子酸组小鼠肝组织中Caspase-3mRNA及蛋白表达明显增强，其中生首乌组和没食子酸组升高十分显著(P＜0.01)，提示肝细胞开始发生凋亡。各给药组的药物代谢酶CYP1A1、CYP3A4蛋白表达均出现不同程度的上调，生首乌组、没食子酸组能够显著诱导CYP1A1、CYP3A4蛋白的表达(P＜0.01)，差异具有显著的统计学意义。 结论1．制首乌二氯甲烷提取部位和乙酸乙酯提取部位是其致肝损伤的主要作用部位。二氯甲烷提取物主要含二苯乙烯苷、大黄素；乙酸乙酯提取物主要含没食子酸、大黄酸、大黄素。 2．大黄素、大黄酸、没食子酸均可以抑制HepG2细胞的活性，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性。二苯乙烯苷在高浓度下未对细胞产生明显抑制。 3．大黄素、大黄酸、没食子酸能够诱导HepG2细胞中CYP1A1、CYP3A4酶的表达，继而增加相应酶底物的生物转化率，从而起到活化增毒的作用。 4．生首乌与没食子酸组对小鼠的肝功能产生了明显的损伤，其是通过诱导CYP1A1、CYP3A4mRNA和蛋白的表达，进而激活凋亡因子Caspase-3的表达。
NETL