摘要
2型糖尿病(Type 2 diabetic mellitus, T2DM)是一种以胰岛素抵抗为特征的慢性代谢性疾病，中医属于“消渴病”的范畴，截止2018年我国已经成为世界上糖尿病患病人数最多的国家，在糖尿病患病群体中约90%以上患者为2型糖尿病。小檗碱(Berberine)，又称黄连素，是从传统中药材黄连CoptischinensisFranch.中提取的一种季铵类生物碱，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种药理作用。研究表明小檗碱还具有较好的降血糖疗效，是公认的降糖效果确切的中药活性成分，但因其多靶点效应的特点，其降糖机制尚未完全明确。 糖原是一种由单一葡萄糖连接而成的多糖物质，因其结构与支链淀粉类似，又被称为动物淀粉，是机体能量的有效贮藏形式。机体肝糖原分子结构分三级：一级结构为葡萄糖经α-1,4-糖苷键连接而成的单链；二级结构为葡萄糖链经α-1,6-糖苷键连接形成的复杂结构，称为β粒子；三级结构是β粒子通过glycogenin蛋白及氢键等聚合而成的多聚体，称为α粒子。肝脏中的糖原多以α粒子的形式储存，在特定生理条件下，α粒子会降解为β粒子，同时，α粒子和β粒子可在代谢酶的作用下，转化成能为机体提供能量的葡萄糖入血。在某些病理条件下，如糖尿病状态下，糖原的三级结构不稳定使其降解速率异常增高，则可能导致糖代谢紊乱等病理特征。因此，通过改善糖原结构调节血糖水平可能是缓解糖尿病病症的有效途径。 糖原磷酸化酶(GP)是肝脏糖原代谢过程中的关键限速酶，可以催化糖原糖链末端的α-1,4-糖苷键的分解断裂过程，是缓解糖尿病病症的有效靶点，但是对于小檗碱是否能够作用于GP还未见深入研究。本课题基于糖原磷酸化酶和肝糖原结构这两方面，深入探讨小檗碱调节糖尿病小鼠肝糖代谢的机制，为小檗碱临床应用的进一步开发提供理论依据，同时也为降糖药的开发提供新的靶点。 第一部分小檗碱缓解2型糖尿病小鼠高血糖症状的药效学研究 以db/db小鼠作为糖尿病模型鼠，二甲双胍(300 mg/kg)作为阳性对照药物，连续8周给予口服小檗碱(300 mg/kg)进行干预，考察小檗碱对糖尿病模型db/db小鼠糖尿病症状及体态体征的影响。 实验期间监测小鼠的空腹血糖、体重及摄食饮水量，评价在小檗碱干预下糖尿病模型db/db小鼠的变化。实验结束后，取小鼠的血清和肝脏组织作为样本，检测血清中血糖调节激素水平，结合ITT实验评价小檗碱对糖尿病模型db/db小鼠胰高血糖素水平及胰岛素敏感性的影响。同时，检测小鼠血清中肝脏损伤因子及肝脏中的糖原含量，结合肝脏组织的H&E染色和PAS染色，评价小檗碱对糖尿病模型db/db小鼠肝脏结构、功能和糖原含量的影响。 本部分实验结果表明，小檗碱可以有效降低糖尿病模型db/db小鼠异常升高的血糖水平、胰高血糖素水平和胰岛素水平，并提高胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗，改善其肥胖、多饮、多食、多尿等症状。同时，小檗碱还可以有效降低糖尿病模型db/db小鼠血清肝损伤因子水平，改善糖尿病模型db/db小鼠肝脏功能，减少其肝脏组织中的过多的脂肪和糖原沉积。 第二部分小檗碱改善2型糖尿病小鼠肝糖代谢的机制研究 实验结束后，取小鼠的肝脏组织作为检测样本，通过ELISA法和WesternBlot法检测小鼠肝脏组织中糖原分解代谢、糖异生过程及其相关信号通路蛋白的活性和表达量，以此探究小檗碱改善糖尿病模型db/db小鼠肝糖代谢的机制。 实验结果显示，小檗碱可以有效抑制糖尿病模型db/db小鼠糖原分解代谢过程中的关键限速酶GP和GDBE的活性，同时还可以有效下调肝脏组织中cAMP-PKA信号通路上的关键蛋白的表达量，进而抑制GP的蛋白表达；此外，小檗碱可以有效抑制糖尿病模型db/db小鼠糖异生过程中的关键限速酶PEPCK和G-6-Pase的活性，同时还可以通过影响HNF-4α和p-AMPK的表达来抑制PEPCK和G-6-Pase的蛋白表达。 本部分实验结果表明，小檗碱可以通过下调cAMP-PKA信号通路抑制肝糖原的分解代谢过程，同时可以通过影响HNF-4α和p-AMPK的表达抑制糖异生过程。小檗碱通过对肝糖原分解代谢和糖异生的有效抑制，可以达到有效改善糖代谢，降低血糖，缓解糖尿病模型db/db小鼠症状的目的。 第三部分小檗碱影响2型糖尿病小鼠肝糖原结构的研究 以蔗糖密度梯度离心法提取小鼠肝糖原，通过TEM方法、SEC方法和FACE方法检测小鼠肝糖原在DMSO处理前后的尺寸分布、密度分布及肝糖原的链长分布，以此来评价小檗碱对糖尿病模型db/db小鼠肝糖原结构的影响。 实验结果显示，所有小鼠的肝糖原在DMSO处理前均以α粒子形式存在，而糖尿病模型db/db小鼠肝糖原在DMSO处理后极易发生结构变化，降解为较多的β粒子，表现为受损而不稳定的糖原结构。小檗碱可以有效修复糖尿病db/db小鼠肝糖原的受损结构，使其在DMSO处理后仍以完整的α粒子存在。此外，糖尿病模型db/db小鼠肝糖原中存在较高比例的长直链，高比例长直链的存在使其二级、三级结构连接不紧密而极易受到外力而降解。小檗碱可以显著改变糖尿病db/db小鼠肝糖原的链长分布，增加其短支链的比例，使其结构更加紧密。 本部分实验结果表明，小檗碱可以改变糖尿病db/db小鼠肝糖原的链长分布，修复其糖原受损的结构，提高其糖原的结构稳定性，使其糖原在体内更不易降解为葡萄糖，改善其糖代谢，降低糖尿病db/db小鼠异常升高的血糖，缓解其糖尿病症状。 第四部分小檗碱影响2型糖尿病小鼠肝糖原降解速率的研究 以蔗糖密度梯度离心法提取小鼠肝糖原，通过体外模拟小鼠肝糖原体内降解过程，检测不同小鼠肝糖原在GP作用下的体外降解速率，以此评价小檗碱对糖尿病模型db/db小鼠肝糖原降解速率及其与GP亲和力的影响。 实验结果显示，糖尿病模型db/db小鼠肝糖原的降解速率远高于健康小鼠，与GP的亲和力也远高于健康小鼠。小檗碱可以显著降低糖尿病db/db小鼠肝糖原的降解速率，降低其与GP的亲和力。 本部分实验结果表明，小檗碱可以有效降低糖尿病模型db/db小鼠肝糖原与GP的亲和力，降低其的降解速率，改善糖尿病db/db小鼠异常的糖代谢，降低其过高的血糖水平，缓解其糖尿病症状。
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