摘要
目的:以中医“肾藏精，精生髓”为理论基础，基于GRP78/CAMKⅡ信号途径，探讨六味地黄丸含药血清对Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞内质网应激的影响，揭示六味地黄丸防治阿尔茨海默病的可能作用机制。 材料与方法：六味地黄丸含药血清制备：30只大鼠随机分为正常组及六味地黄丸组，六味地黄丸组大鼠采用生药质量浓度为1.18g﹒kg-1﹒d-1六味地黄丸(浓缩丸)水溶液灌胃，连续5日，每日2次，末次2h后取血，提取六味地黄丸含药血清，正常组大鼠相同条件下双蒸水灌胃，提取正常组血清；本实验分为3组：空白对照组、模型组及六味地黄丸含药血清组，空白对照组与模型组采用含10%正常组大鼠血清DMEM高糖培养基培养，六味地黄丸含药血清组采用含10%六味地黄丸组大鼠含药血清DMEM高糖培养基培养，模型组及六味地黄丸含药血清组加入终浓度为20umoL﹒L-1Aβ1-42寡聚体，继续培养48h后检测；乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH )活力；透射电镜检测SH-SY5Y细胞的内质网超微形态结构变化情况；采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time PCR Quantitative Detecting System ,QPCR)检测各组GRP78、CAMKⅡmRNA表达水平；采用WesternBlot法检测各组GRP78、CALM、CAMKⅡ蛋白表达水平。 结果： 1.各组细胞培养基中LDH活力的变化情况：与空白对照组相比，模型组细胞培养基中的乳酸脱氢酶活力显著增高(p＜0.01)；与模型组相比，六味地黄丸含药血清组细胞培养基中的乳酸脱氢酶活力明显降低(p＜0.05)。 2.透射电镜下观察各组细胞超微形态结构变化情况：空白对照组细胞结构清晰，双层核膜及胞质膜形态完整，内质网形态正常，结构明显；与空白对照组相比，内质网明显扩张，呈空泡状；与模型组相比，六味地黄丸含药血清组细胞接近正常细胞形态，内质网扩张情况明显减轻。 3.QPCR检测各组细胞GRP78、CAMKⅡmRNA表达结果：与空白对照组相比，模型组细胞CAMKⅡmRNA表达水平显著降低(p＜0.01)，GRP78mRNA表达水平显著升高(p＜0.01)；与模型组相比，六味地黄丸含药血清组细胞CAMKⅡmRNA表达水平显著升高(p＜0.01)，GRP78mRNA表达水平明显降低(p＜0.05)。4.WesternBlot检测各组细胞GRP78、CALM、CAMKⅡ蛋白表达结果：与空白对照组相比，模型组细胞CAMKⅡ蛋白表达水平显著降低(p＜0.01)，GRP78、CALM蛋白表达水平显著升高(p＜0.01)；与模型组相比，六味地黄丸含药血清组细胞CAMKⅡ蛋白表达水平显著升高(p＜0.01)，GRP78、CALM蛋白表达水平显著降低(p＜0.01)。 结论： 1.六味地黄丸含药血清可有效改善Aβ1-42诱导SH-SY5Y细胞内质网应激出现的损伤情况。 2.六味地黄丸含药血清可能通过调节GRP78、CALM、CAMKⅡ的基因表达进而发挥改善细胞内质网应激及下游钙离子通道的作用。
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