摘要
目的： 肥胖是一种多病因的慢性代谢性疾病，近年来已证实肠神经系统(ENS)是肥胖参与者，并导致了肥胖相关的胃肠功能障碍。本文基于高脂饲料制备的脾虚湿盛肥胖小鼠模型，探索益气祛痰针法对ENS网络的整体调控规律，及肠神经胶质细胞(EGCs)在局部调节肠道菌群、肠道免疫、肠黏膜屏障而整合调控脂肪吸收、能量代谢和肠道微环境等效应机制，探索“益气祛痰针法刺激穴位——改善整体ENS功能——调控局部EGCs改善肠道微环境”的针刺减肥机制。 方法： 第一部分，肥胖小鼠模型的建立。以易感肥胖的C57BL/6J小鼠为研究对象，采用高脂饲料喂养10周作为方法，复制肥胖小鼠动物模型，按照预定标准筛选出肥胖模型和肥胖抵抗小鼠。通过食物消耗量，体重和Lee’s指数，血脂四项，血清瘦素(LP)和脂联素(ADPN)，体内脂肪组织，脂肪细胞HE染色，血清炎性因子及肠道派氏小体转录组学差异基因，从不同层次对肥胖小鼠模型进行评价。 第二部分，益气祛痰针法对肥胖小鼠肥胖参数及血清代谢组学的影响。采用第一部分制备成功的肥胖小鼠分为肥胖模型组(M组)，干预14天(A14组)、干预21天(A21组)和干预28天(A28组)，加上肥胖抵抗小鼠(D组)和正常小鼠(N组)，每组10只小鼠。干预组采用益气祛痰针法，电针刺激天枢、关元、足三里和三阴交4个穴位，N组、M组和D组实验鼠以同样的方式和时间固定，但不行任何干预。观察各组实验小鼠的体重和体内脂肪组织重量，计算Lee’s指数，HE染色脂肪细胞长径，血脂及脂肪因子含量，血清炎性因子MCP-1、IL-1β、IL-4和IL-10水平及血清代谢组学变化。 第三部分，益气祛痰针法对肥胖小鼠肠神经系统整体调控。采用比色法，测量血清氨基酸神经递质γ-GABA和Glu的含量，运用HE染色判断各组ENS病理状况，碳末推进实验计算肠道传输率(ITR)，ELISA法检测VIP、SP和5-HT神经递质。WesternBlot和RT-PCR检测ENS中PGP9.5，ChAT和nNOS的蛋白及基因表达，免疫组化法检测神经营养因子GDNF和GAT2表达。 第四部分，益气祛痰针法对局部EGCs的调控和肠道微环境的影响。使用荧光单标或双标检测HuD/HuC、GFAP、Sox10和S100β蛋白表达，评估EGCs或亚型密度变化；运用ELISA、WesternBlot、RT-PCR等方法检测血浆LPS、PGN含量，TLR4、MyD88、NF-кB蛋白和基因表达，探讨益气祛痰针法调节肠道菌群与EGCs作用，从而激活TLR4-MyD88-NF-кB炎症通路的情况；AB-PAS染色法计数杯状细胞，ELISA测定MCU2和TFF3含量，评估益气祛痰针法介导EGCs干预肠道黏膜免疫；最后使用16SrRNA方法，观察益气祛痰针法对分段小肠的肠道菌群丰度和多样性影响。 结果： 肥胖模型组和肥胖抵抗组的食物消耗量处于同一水平，均低于普通饮食组，但肥胖模型小鼠的体重、Lee’s指数、CHO、TG、LP、体内脂肪组织重量、脂肪细胞长径、IL-1β和MCP-1含量显著高于普通饮食组和肥胖抵抗组(P＜0.01或P＜0.001)，HDL-C和ADPN明显低于普通饮食组和肥胖抵抗组(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，肥胖小鼠、肥胖抵抗小鼠和普通饮食小鼠的差异基因在多个数据库富集，与能量脂质代谢的多条通路相关。 益气祛痰针法干预后，肥胖小鼠体重、Lee’s指数、体内脂肪组织重量、脂肪细胞长径、血清CHO、TG、LP、MCP-1和IL-1β水平显著降低(P＜0.001或P＜0.01)，血清ADPN、HDL-C、IL-4和IL-10含量明显升高(P＜0.001或P＜0.01)，且益气祛痰针法干预21天效果最佳。实验小鼠血清代谢组学结果显示，差异显著的代谢物主要包括α-亚麻酸、花生四烯酸、DL-色氨酸、戊二酸、赖氨酸、甘氨酸和谷氨酸等。差异代谢物富集到KEGG数据库发现，除了与不饱和脂肪酸、花生四烯酸和甘油磷脂代谢途径相关外，还与谷氨酸、丙氨酸和甘氨酸相关的氨基酸代谢有关。 肥胖模型小鼠的PGP9.5、ChAT和nNOS蛋白和基因表达水平较普通饮食小鼠和肥胖抵抗小鼠显著下调(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，ENS出现结构不清晰，神经细胞数量减少，纤维排列紊乱等病理变化。ITR变慢(P＜0.001)，γ-GABA和Glu含量降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。益气祛痰针法干预后，电针21天和28天组可以降低ENS的病理积分(P＜0.05或P＜0.01)，上调肠神经PGP9.5、ChAT和nNOS的蛋白和基因表达(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，同时也上调GDNF和GAT2蛋白和基因表达(P＜0.01或P＜0.001)，并增快ITR(P＜0.001)，良性调节SP、VIP和5-HT等肠神经递质的水平(P＜0.01或P＜0.001)。 GDNF和GAT2蛋白和基因表达(P＜0.01或P＜0.001)，并增快ITR(P＜0.001)，良性调节SP、VIP和5-HT等肠神经递质的水平(P＜0.01或P＜0.001)。 肥胖模型小鼠EGCs和亚型蛋白密度减弱(P＜0.01或P＜0.001)，肠道菌群的丰度和多样性下降，血浆LPS和PGN含量显著升高(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，肠道通透性增加，激活EGCs介导的TLR4-MyD88-NF-КBP65炎症应答通路；杯状细胞计数减少(P＜0.05或P＜0.01)，空肠中MCU2和TFF3含量降低(P＜0.01或P＜0.001)。益气祛痰针法干预后可以提高EGCs和亚型蛋白密度(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，恢复肠道菌群的丰度，接近普通小鼠肠道菌群水平；从肠道粘膜免疫，肠道通透性及抑制TLR4-MyD88-NF-КBP65炎性通路转导改善肠道微环境。 结论： ①采用HFD饲料喂养易感肥胖的C57BL/6J小鼠10周，成功制备脾虚湿盛之肥胖模型。 ②以益气祛痰针法为干预手段，显著降低肥胖模型小鼠各项肥胖参数，且21天益气祛痰针法干预效果最佳，血清代谢组学显示差异显著的代谢物集中在能量、脂类和氨基酸代谢。 ③益气祛痰针法改善肥胖模型小鼠ENS病理评分，上调相关蛋白基因表达，增强神经营养因子的蛋白和基因表达，增快肠传输速率，良性调节肠神经递质的水平。 ④益气祛痰针法提高EGCs和亚型蛋白密度，恢复肠道菌群丰度和多样性，介导EGCs调节肠道黏膜免疫，肠道通透性及抑制炎性信号通路转导，从而改善肠道微环境。 ⑤探索“益气祛痰针法刺激穴位——改善整体ENS功能——调控局部EGCs改善肠道微环境”的针刺减肥机制。
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