摘要
背景： 结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种在全世界范围内高发的恶性肿瘤，对人们的健康产生了严重的危害。与大多数实体瘤类似，CRC的分子发病机制较为复杂，其中APC、TP53等重要抑癌基因的失活是其发病的重要基础。因此深入研究并阐明抑癌基因的表达调控对正确理解、认识CRC的发病机理具有重要的意义。最近，我们利用全外显子组测序及功能实验，首次报道抑癌基因RASSF6(Ras-association domain family number 6)的表达缺失或下调参与CRC的发生、发展。MicroRNA，作为一种调控mRNA表达水平的短序列非编码RNA受到越来越多的重视。我们前期利用生物信息学方法分析确定RASSF6上游CRC新致癌miRNA(miR-496)。就我们掌握的文献，到目前为止，系统分析RASSF6上游miRNAs的靶向调控以及miR-496在CRC发生、发展中的分子作用机制还未见报道。因此，本研究的完成有助于我们进一步认知CRC发生、发展过程中RASSF6的表达调控网络，明确新致癌基因miR-496的作用机制，具有重要的理论意义。 研究方法： 1、利用microRNA.org在线预测软件、PubMed数据库、TCGA数据库中CRC临床样本的相关数据及信息分析确定CRC的新致癌miRNA：miR-496。 2、利用Q-PCR从mRNA水平分析miR-496和RASSF6在CRC临床组织样本及其对应的癌旁组织样本的表达。 3、利用双荧光素酶报告系统检测miR-496与RASSF63’-UTR的靶向关系。 4、基于细胞(SW480和LoVo)层面，利用Westernblot从蛋白水平验证miR-496对RASSF6的表达影响。 5、选取SW480及LoVo细胞系，分别转染miR-496mimics或inhibitor。通过CCK8、克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell迁移实验比较miR-496对CRC细胞增殖和迁移能力的影响。选取SW480细胞系，利用Westernblot检测迁移及EMT相关标识分子的蛋白表达是否有与上述一致的趋势。 6、在SW480及LoVo细胞系中，利用Transwell进行Rescue试验验证miR-496直接靶向RASSF6抑制结直肠癌细胞迁移能力。选取SW480细胞系，利用Westernblot进行Rescue试验检测迁移及EMT相关标识分子的蛋白表达是否有与上述一致的趋势。 7、选取SW480细胞系，转染miR-496mimics或inhibitor，利用Westernblot检测Wnt信号途径是否被激活或抑制，同时进行Rescue试验验证miR-496mimics或inhibitor诱导的Wnt信号途径的激活或抑制是否与RASSF6相关。 结果： 1、生物信息学分析确定CRC的新致癌miRNA：miR-496；双荧光素酶报告系统检测实验结果证实RASSF6是miR-496的靶基因；SW480及LoVo细胞系转染miR-496mimics/inhibitor后RASSF6蛋白表达水平相应改变。 2、临床样本中miR-496在结直肠癌组织中的表达明显高于邻近正常组织，RASSF6在结直肠癌组织中的表达则低于邻近正常组织，且两者存在明显的负相关关系。 3、SW480及LoVo细胞系转染miR-496mimics后，细胞增殖速度和克隆形成数目均没有差异变化，细胞迁移能力增强；转染miR-496inhibitor后，细胞增殖速度和克隆形成数目也没有差异变化，细胞迁移能力降低。 4、Rescue试验中，通过Transwell实验分析确定，敲低RASSF6促进了LoVo和SW480细胞的迁移能力，抑制miR-496可以减弱这些影响；相反，RASSF6的过表达降低了LoVo和SW480细胞的迁移能力，miR-496的过表达可以减弱这些影响。 5、在SW480细胞系中，转染miR-496mimics/inhibitor后，Wnt信号传导标识分子，迁移标识分子，EMT标识分子的蛋白表达均有差异变化。Rescue试验结果显示抑制miR-496可以减弱RASSF6低表达对CRC转移、EMT和Wnt信号传导的促进作用；miR-496过表达可以减弱RASSF6高表达对CRC转移、EMT和Wnt信号传导的抑制作用。 结论： miR-496靶向抑制RASSF6的表达，通过激活Wnt信号传导通路促进CRC细胞的迁移能力和上皮-间充质转化(EMT)。这暗示了miR-496在CRC中充当癌基因的角色。
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