摘要
植物2C型蛋白磷酸酶(Protein phosphatase 2C，PP2C)参与多种信号转导通路,其中A类PP2C是ABA信号通路的关键调控因子，而ABA在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着不可或缺的作用。小麦是重要的粮食作物，然而关于小麦PP2C基因的研究却极少，更没有针对其A类PP2C功能研究的报道。此外由于普通小麦是异源六倍体，具有复杂且庞大的基因组，这给小麦基因功能研究带来巨大挑战。近年来，高质量小麦参考基因组序列草图的完成极大地加快了小麦功能基因组学研究进程。本研究首先对小麦TaPP2C基因家族进行了全基因组鉴定和分析，在此基础上选择A类TaPP2C进行功能研究，并重点对其中的TaPP2C-a10和TaPP2C-a7进行了功能分析。主要的研究内容和结果如下： (1)在六倍体小麦参考基因组数据库中共鉴定到95个TaPP2C基因，其中80%的TaPP2C基因在A、B和D亚基因组上都有拷贝存在。进化树分析结果表明，TaPP2C蛋白主要分为13个亚类(A-M)。基于公共RNA-seq数据，对TaPP2C基因表达模式的分析结果表明，一部分TaPP2C基因的表达具有组织特异性，且TaPP2C基因参与了热、干旱等非生物胁迫响应以及条锈病等生物胁迫响应。此外，一些TaPP2Cs的A、B和D部分同源基因(Homoeologs)在相同环境下的表达水平存在较大差异。 (2)对A类TaPP2C基因的RT-qPCR分析结果显示，TaPP2C-a1、a3、a4、a5、a7、a8、a9和a10都能明显响应ABA处理，其中TaPP2C-a7、a10等基因还能响应GA、干旱和盐胁迫，表明A类TaPP2Cs可能参与ABA等激素信号通路及干旱等非生物胁迫响应；对A类TaPP2C基因启动子顺式元件的分析也支持该结论。从模式小麦中国春中克隆了A类TaPP2C基因，利用酵母双杂实验分析A类TaPP2Cs与ABA信号调控因子TaSnRK2s、TaPYL4的互作关系，结果表明这些A类TaPP2Cs都能与III类TaSnRK2互作，还能与II类中的TaSnRK2.1/2.2互作；TaPP2C-a7等部分A类TaPP2Cs依赖于ABA与TaPYL4互作，表明A类TaPP2Cs参与调控ABA信号通路。一些A类TaPP2Cs在种子中特异性表达，因此对A类TaPP2Cs与种子休眠调控因子TaDOG1Ls的互作关系进行了分析。结果表明，TaPP2C-a10能够与TaDOG1L1、TaDOG1L4互作。 (3)亚细胞定位分析结果显示，TaPP2C-a10定位于细胞核，双分子荧光互补分析结果显示TaPP2C-a10能够与TaDOG1L4在细胞核中互作；RT-qPCR分析结果显示TaPP2C-a10在种子发育后期大量表达，这些结果表明TaPP2C-a10可能参与调控种子休眠和萌发。为了验证这一猜想，将TaPP2C-a10转化模式植物拟南芥进行分析，发现TaPP2C-a10转基因拟南芥种子的休眠水平降低。转基因拟南芥还表现出对ABA不敏感的表型，在ABA处理下，其种子萌发率、萌发后生长率以及主根生长均较高于野生型。进一步分析发现，TaPP2C-a10转基因拟南芥中ABA响应基因的表达水平下降，表明TaPP2C-a10能够负调控转基因拟南芥的ABA信号通路。此外，进化分析结果表明含TaPP2C-a10在内的AHG-like基因在被子植物中较为保守。 (4)对TaPP2C-a7的功能进行进一步探究发现，TaPP2C-a7也能够通过负调控ABA信号来降低ABA对其转基因拟南芥种子萌发、萌发后生长和主根生长的抑制作用。不过，TaPP2C-a7并不影响其转基因拟南芥种子的休眠水平。TaPP2C-a7转基因拟南芥还表现出对干旱的耐受性降低，表达分析结果表明，TaPP2C-a7可能通过ABA依赖型和非ABA依赖型途径调控转基因拟南芥的干旱胁迫响应。酵母单杂分析结果显示，转录因子TaMyb1D和TaMybU可以结合TaPP2C-a7基因启动子中含有MBS元件(干旱诱导相关的MYB结合位点)的片段。此外，TaPP2C-a7/a10还能够与TaCBL3/9、TaCIPK11互作，表明TaPP2C-a7/a10可能参与调控离子通道的活性。 (5)对TaPP2C-a9转基因拟南芥的表型分析结果表明，TaPP2C-a9也能够负调控ABA信号通路。由于TaPP2C-a7、a9、a10等蛋白都属于A类TaPP2Cs中的AHG1亚类，说明AHG1亚类TaPP2Cs在ABA信号中的功能可能具有保守性。 这些发现为深入研究TaPP2C基因的功能奠定了基础，并为小麦ABA信号通路作用机制的研究提供了重要线索。
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