摘要
油樟是一种材用、药用兼之的芳香植物，其精油成分中松油醇含量丰富，并同时含有α-松油醇、松油烯-4-醇和δ-松油醇三种同分异构体。本文以油樟叶为材料，三种同分异构松油醇为对象，研究了三种同分异构松油醇的抑菌活性及机理，尝试了三种同分异构天然松油醇的生物(内生菌)和物理高产途径，为天然松油醇应用领域的开拓和生产提供理论支撑和借鉴。研究的主要结论如下： (1)三种同分异构松油醇的抑菌作用 α-松油醇、松油烯-4-醇和δ-松油醇对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用，其中α-松油醇的最小抑菌浓度(MIC)范围为0.3900~1.5623μL/mL，最小杀菌浓度(MBC)为1.5625~3.1250μL/mL；松油烯-4-醇对四种食源性病原菌MIC均为0.7800μL/mL，MBC范围为0.7800~1.5625μL/mL；δ-松油醇的MIC范围为0.7800~1.5625mg/mL，MBC为1.5625~3.1250mg/mL。时间杀菌曲线显示4种食源性病原菌对三种同分异构松油醇呈浓度依赖型。三种同分异构松油醇的抑菌机理结果表明同分异构松油醇的抑菌作用靶点相似，主要作用于细菌细胞膜和细胞壁。胞内核酸、蛋白质的泄露、膜电位的去极化以及碘化丙啶(PI)染色显示α-松油醇、松油烯-4-醇和δ-松油醇可造成志贺氏菌细胞膜通透性增强，碱性磷酸酶泄露表明志贺氏菌细胞壁结构损坏。电镜扫描显示α-松油醇、松油烯-4-醇和δ-松油醇可使志贺氏菌表面出现褶皱，边界模糊，松油烯-4-醇和δ-松油醇作用的个别菌株还出现空洞和溶解。 (2)油樟同分异构松油醇的内生菌生产途径探索 采用组织块法、研磨法和中和剂辅助法分离油樟叶内生细菌，其中，中和剂辅助法结合LB培养基和研磨法结合卵凝脂吐温-80培养基可分别获得最多数量和种属的油樟叶内生细菌。按照菌落形态特征排重后共保存176株油樟叶内生细菌，经鉴定分属于Bacillus、Lysinibacillu、Staphylococcus、Microbacterium、Micrococcus、Rothia、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria、Virgibacillus、Sphingomonas、Acinetobacter和Chryseobacterium的34个种。除Bacillus和Lysinibacillu外，其余11个属均首次从油樟叶中分离得到。其中Bacillus为第一优势属。 34株不同种属油樟叶内生细菌中，筛选到一株松油醇高产菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)内生细菌，编号T3-M-39。其培养液中可检测到α-松油醇1.075mg/L，松油烯-4-醇0.536mg/L，未检测到δ-松油醇。以T3-M-39为出发菌株，30W紫外灯30cm照射2min为最佳诱变条件下，致死率达74.07%。此时，最佳正向突变菌株产α-松油醇和松油烯-4-醇能力较出发菌株分别提高了34.85%和26.68%，遗传稳定性良好。 (3)油樟同分异构松油醇的净油生产途径探索 采用正己烷回流提取油樟净油，并与水蒸气蒸馏法提取的油樟精油比较发现油樟净油在3.5~4.5min之间物质消失，15-19min之间物质出现。油樟净油和精油分别鉴定组分31种和29种，共有成分19种。油樟净油中α-松油醇、松油烯-4-醇和δ-松油醇含量依次为50.75g/L、24.84g/L和1.71g/L，其中松油烯-4-醇含量较油樟精油中提高了66.38%，用该方法可显著提高油樟挥发油中松油烯-4-醇含量。抗氧化测定结果显示：12mg/mL时净油对DPPH·的清除率是精油的3.93倍，对ABTS·清除率比精油增加了103.98%。净油对DPPH·和ABTS·的EC50分别为4.02mg/mL和2.88mg/mL，实验浓度范围内精油均未达到EC50。
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