摘要
第一部分：MyD88抑制剂TJ-M2010-5抑制MyD88二聚化的作用及对小鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用 【目的】探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5抑制MyD88二聚化的作用，以及对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机理。 【方法】将Flag-MyD88和HA-MyD88质粒组合，以及Flag-TIRAP和HA-MyD88质粒组合分别共转染至大鼠心肌细胞株H9C2细胞，给予不同浓度的TJ-M2010-5干预(0,15,30μmol/L)，转染48小时后通过免疫共沉淀法检测MyD88-MyD88以及MyD88-TIRAP的结合能力，来评估TJ-M2010-5对MyD88二聚化的作用。通过建立小鼠心肌缺血再灌注模型，使用7-0带针线暂时结扎左前降支(LAD)造成心肌缺血30分钟之后再剪开结扎线使心肌再灌注。实验分为四组：假手术(Sham)组、溶媒(ddH2O)组、TJ-M2010-5组以及MyD88-/-组。小鼠在术前48h、24h、6h分别腹腔注射溶媒ddH2O以及药物TJ-M2010-5。收集并检测Sham组和ddH2O组小鼠的心脏组织MyD88mRNA和蛋白表达水平。免疫荧光观察Sham组和ddH2O组心肌组织中α-actinin+心肌细胞、F4/80+巨噬细胞及vimentin+细胞中的MyD88表达情况。各组提取心脏组织总蛋白，检测MyD88蛋白的表达水平。再灌注24h后对各组小鼠进行心脏超声检测LVIS、LVID并计算EF和FS值，评估心功能。收集各组小鼠的血清标本和心脏标本，分别检测血清中心肌酶cTNI、CK-MB、LDH水平，伊文思蓝-TTC双染色计算缺血面积(AAR)、梗死面积(AI)以及二者的比值(AI/AAR)。HE染色观察心脏病理改变；免疫组化观察心脏MPO、F4/80的表达；TUNEL荧光观察α-Actinin+心肌细胞凋亡率；心脏组织消化分离出单细胞后进行流式细胞术检测CD45+白细胞总比例，Ly-6G+CD11b+中性粒细胞比例，F4/80+CD11b+巨噬细胞比例及其中MHCⅡ+CD86+巨噬细胞活化程度；qRT-RCR及ELISA检测炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平。提取心脏组织总蛋白，检测TLR2、TLR4以及P38、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平，Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase3凋亡蛋白水平，AP-1、COX-2炎症相关蛋白水平。提取心脏组织核蛋白及浆蛋白，检测NF-κB核转移情况。获取再灌注28d的各组小鼠心脏组织，进行Masson染色，免疫组化检测CollegenⅠ、CollegenIII、Fibronectin和α-SMA评估纤维化程度，提取心脏组织总蛋白，检测CollegenⅠ、CollegenIII、Fibronectin和α-SMAmRNA和蛋白表达水平。 【结果】ddH2O组小鼠心脏组织较Sham组在mRNA和蛋白水平均高表达MyD88，mRNA水平在再灌注2h后即明显升高，并持续升高至再灌注后28d；心脏组织免疫荧光双染或三染结果提示，再灌注24h后MyD88高表达于α-actinin+心肌细胞及F4/80+巨噬细胞，再灌注28天MyD88高表达于vimentin+细胞。TJ-M2010-5干预可以抑制MyD88-MyD88和MyD88-TIRAP的结合，呈剂量依赖性。与ddH2O组相比较，给予TJ-M2010-5处理后，心脏彩超检测LVIS、LVID显著减低，EF、FS明显升高；心肌梗死面积显著减少；血清中心肌酶cTNI、CK-MB、LDH水平明显降低；心脏标本中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达以及血清中各细胞因子减少(P<0.05)；HE染色显示细胞变性坏死、炎症细胞浸润等损伤程度明显减轻，免疫组化检测MPO、F4/80表达量明显减少，TUNEL凋亡检测TUNEL+α-Actinin+心肌细胞凋亡率明显减少(P<0.05)；流式细胞术分析心脏组织中CD45+白细胞总比例，Ly-6G+CD11b+中性粒细胞比例，F4/80+CD11b+巨噬细胞比例及其中MHCⅡ+CD86+巨噬细胞活化程度均显著降低(P<0.05)；蛋白水平上，TLR2、TLR4以及P38、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平，Bax、cleaved-Caspase3、AP-1、COX-2的表达，NF-κB核转移均明显降低，Bcl-2表达水平增加(P<0.05)。心脏纤维化方面，与ddH2O组相比较，给予TJ-M2010-5处理后，Masson染色结果表明心肌纤维化减少，心脏组织中CollegenⅠ、CollegenIII、Fibronectin和α-SMA的沉积明显减少；蛋白水平，CollegenⅠ、CollegenIII、Fibronectin和α-SMA蛋白表达显著降低(P<0.05)。 【结论】MyD88分子高表达于心肌缺血再灌注损伤后的心脏组织。TJ-M2010-5可以剂量依赖性的抑制MyD88同源和异源二聚化。TJ-M2010-5可减轻心肌缺血再灌注损伤炎症反应及纤维化，这种保护作用主要源自于对NF-κB和MAPK信号通道的抑制，从而抑制了炎症反应而发挥保护心功能的作用。 第二部分：MyD88抑制剂TJ-M2010-5对原代心肌细胞、巨噬细胞及成纤维细胞的影响及机制 【目的】探讨MyD88抑制剂TJ-M2010-5对缺氧复氧损伤后原代心肌细胞，巨噬细胞、成纤维细胞的活化及迁移影响及机理，为TJ-M2010-5进一步临床应用提供实验依据。【方法】分离、提取C57BL/6乳鼠的原代心肌细胞和原代成纤维细胞，6-8周C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)体外培养。CCK-8实验检测不同浓度MyD88抑制剂TJ-M2010-5(0，5，15，30μmol/L)分别对原代心肌细胞、成纤维细胞以及BMDMs是否具有细胞毒性作用。检测缺氧复氧后的心肌细胞以及用缺氧复氧损伤后的心肌细胞培养上清刺激后的BMDMs和原代成纤维细胞中MyD88蛋白的表达水平。原代心肌细胞进行缺氧复氧(A/R)过程，同时给予不同浓度TJ-M2010-5干预(0，5，15，30μmol/L)，流式细胞术检测AnnecxinV-PI心肌细胞凋亡水平，qRT-PCR检测心肌细胞表达炎性细胞因子IL-1β、IL-6的mRNA水平以及细胞培养上清中的分泌水平；Westernblot检测心肌细胞中P38、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平，以及Bcl-2和cleaved-Caspase3的凋亡蛋白水平。提取心肌细胞的核蛋白及浆蛋白，检测NF-κB核转移情况。将缺氧复氧损伤后的心肌细胞培养上清与BMDMs和原代成纤维细胞分别混培，给予不同浓度的TJ-M2010-5干预(0，5，15，30μmol/L)，流式细胞术检测BMDMs表面标记分子MHCⅡ+CD86+活化情况；qRT-PCR检测BMDMs炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6转录水平以及细胞培养上清中的分泌水平；Westernblot检测BMDMs表达P38、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平。提取BMDMs核蛋白及浆蛋白，检测NF-κB核转移情况。qRT-PCR检测成纤维细胞中α-SMA的蛋白表达水平。将缺氧复氧损伤后的心肌细胞培养皿中放入transwell下室，小室中分别加入BMDMs和原代成纤维细胞，给予不同浓度的TJ-M2010-5干预(0，5，15，30μmol/L)，24h后观察这两种细胞的迁移情况。 【结果】缺氧复氧的心肌细胞及其刺激的BMDMs和原代成纤维细胞中均高表达MyD88蛋白。TJ-M2010-5在30μmol/L的浓度范围内，对小鼠原代心肌细胞、成纤维细胞和BMDMs无细胞毒性作用。体外培养的乳鼠原代心肌细胞经历缺氧复氧损伤后，给予不同浓度TJ-M2010-5干预，可以显著减少心肌细胞的凋亡率，抑制心肌细胞中P38、ERK、JNK等蛋白的磷酸化水平，抑制NF-κB核转移，以及减少IL-1β、IL-6的表达和分泌水平。与缺氧复氧损伤后的心肌细胞上清共培养的BMDMs和原代成纤维细胞，给予不同浓度TJ-M2010-5干预后，可以显著抑制BMDMs的P38、ERK、JNK等蛋白的磷酸化水平，抑制NF-κB核转移，以及减少IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌水平，抑制成纤维细胞的α-SMA蛋白表达水平。给予不同浓度TJ-M2010-5干预后，与缺氧复氧后的心肌细胞混配的BMDMs和原代成纤维细胞迁移率明显降低(P<0.05)。 【结论】缺氧复氧损伤后的心肌细胞及其刺激的BMDMs和原代成纤维细胞中均高表达MyD88蛋白。TJ-M2010-5干预后抑制了缺氧复氧后心肌细胞的凋亡水平及其NF-κB和MAPK信号通道，抑制了刺激后的BMDMs的NF-κB和MAPK信号通道，以及BMDMs和成纤维细胞的活化和迁移。这为TJ-M2010-5进一步的临床应用提供实验依据。
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