摘要
目的：生长激素（Growth Hormone,GH）在哺乳动物生长、发育和代谢等生理过程中发挥着重要作用，在动物体内通过与靶细胞膜表面生长激素受体（Growth Hormone Receptor,GHR）相结合而行使生物学功能。若GHR发生突变，GH将失去其生物学效应并引发不良后果，如导致人类莱伦氏综合征（Laron syndrome）等。巴马猪具有体型小、寿命长、妊娠周期短、产仔数多、抗感染和抗病力强的特点，另外巴马猪与人类在生理学和病理学上的医学特征极为相似，因而其作为疾病模型动物在生物医学研究上拥有极高的研究价值。本研究拟通过CRISPR/Cas9技术制备GHR敲除巴马猪细胞，以期未来能够进一步利用体细胞克隆技术产生出体型更小的GHR敲除巴马猪。体型更小的巴马猪将更利于实验操作并能减少饲养管理成本，且可作为Laron综合征动物模型为医学研究奠定基础。 方法：一、采用组织块贴壁法和胰蛋白酶消化法获得原代雄性和雌性巴马猪肾脏成纤维细胞。二、通过sgRNA设计工具（）在线选择设计两组sgRNA，通过退火引物和质粒连接，再通过转化、挑菌及扩培等步骤构建靶向GHR基因第一外显子的CRISPR/Cas9编辑质粒，双酶切验证质粒构建结果。三、优化脂质体转染和筛选方案，并通过转染两组CRISPR/Cas9质粒直接测序比较两组质粒靶向靶位点的编辑效率。四、选择转染效率更高的质粒转染雄性和雌性肾脏成纤维细胞，筛选分离出发生突变的单克隆细胞株，并测序分析得出所有突变基因型。五、突变单克隆细胞株进行质粒载体整合情况的检测和脱靶分析。 结果：一、成功采集并冷冻数管巴马猪肾脏成纤维细胞，细胞呈长形纤维状，棱角分明。二、成功构建出CRISPR/Cas9质粒：GHR-Cas9-1、GHR-Cas9-2；质粒通过双酶切验证后，条带大小与原质粒长度一致，且直接测序结果与sgRNA序列完全一致。三、脂质体转染方案优化结果为：质粒转染量1μg，Lipofectamine3000量3.75μL，筛选所用嘌呤霉素浓度1.5μg/mL：直接测序结果确定GHR-Cas9-1质粒的转染效率更高。四、通过转染、筛选分离得到雄性单克隆细胞株12个，雌性单克隆细胞株10个；经测序分析发现：22个单克隆细胞株中21个发生双等位基因突变，基因编辑效率为95.45%。五、Cas9质粒载体整合情况的检测结果为：雄性单克隆细胞株中#1，#4，#6，#7，#8，#10，#12这7个未出现Cas9质粒整合；而雌性单克隆细胞株中#1、#5、#6、#7、#8、#9这6个未出现Cas9质粒整合，质粒载体整合率为40.9%；雄性#1、#4单克隆细胞株和雌性#1、#5单克隆细胞株的脱靶预测分析得知四个细胞系均无脱靶的发生。 结论：试验成功获得了21个发生GHR基因突变的单克隆细胞株，并成功分析得出每个突变基因型。质粒嘌呤霉素位点的整合试验分析得出质粒载体整合率为40.9%，且挑选出的四个细胞系无脱靶情况的出现。
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