摘要
目的： 1.探讨SMAC类似物LCL161联合Caspase酶抑制剂(Caspase inhibitors，CI)对乳腺癌耐药细胞的影响； 2.釆用TMT联合质谱蛋白质组学技术，筛选乳腺癌耐药细胞经LCL161联合CI作用下响应的差异蛋白，并通过采用生物信息学分析，探讨差异蛋白之间的相互调控关系及其参与的信号通路。 3.筛选目的差异蛋白，利用平行反应检测技术验证目的蛋白，鉴定LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡的靶标蛋白，研究经过LCL161联合CI处理过后的乳腺癌耐药细胞发生了哪些变化，探索LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡的可能发生机制，为后续治疗乳腺癌耐药和药物靶向标志物提供研究线索。方法： 1.CCK-8法检测LCL161联合CI对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/DDP存活率的影响。 2.采用同位素相对标记与绝对定量(Tandem Mass Tag,TMT)技术，筛选经LCL161联合CI处理后对诱导乳腺癌耐药细胞凋亡相关的差异表达蛋白,并利用生物信息学数据库对所有差异蛋白进行分析。 3.筛选与LCL161联合CI诱导乳腺癌耐药细胞凋亡相关蛋白并利用平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术，鉴定及验证LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡的靶标蛋白。 结果： 1.当LCL161与CI联合应用条件下，与单用LCL161相比能使乳腺癌耐药细胞死亡增加； 2.TMT技术筛选显著差异蛋白：利用蛋白组学共鉴定到5949.0个蛋白质,其中包含定量信息的蛋白有5220.0个。在变化倍数1.2，P<0.05的条件下，我们发现比较组中有92种蛋白表达上调，114种蛋白表达下调。利用基因本体论(gene ontology,GO)从蛋白的生物学活动角度分析表达差异蛋白主要有细胞过程、结合整合、催化活性和信号传导活性等方面。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)提示TMT技术筛选蛋白主要集中在细胞增殖、细胞信号传导及营养物质代谢等过程。 3.PRM验证：根据TMT及生物信息学分析结果，结合蛋白筛选原则选取了4个认为与LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡相关的关键蛋白质，通过PRM验证结果与TMT的总体趋势一致,因此认为筛选的4个蛋白质可能是LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡的关键蛋白质。结论： 1.在Caspase抑制条件下，LCL161能促进MCF-7/DDP细胞发生凋亡。 2.206个显著差异蛋白，24条相关通路共同变化蛋白直接或间接地参与了LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡分子机制。 3.4个差异蛋白经PRM验证与TMT结果一致,验证的蛋白质可能是LCL161联合CI促进乳腺癌耐药细胞凋亡的关键蛋白质。
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