摘要
第一部分AtraseB在体外抑制补体的作用 【目的】以猪主动脉内皮细胞系(iPECs)为靶细胞，通过异种抗体介导补体依赖的细胞毒模型来检测atraseB抑制补体激活的能力和探索其中的机制。 【方法】收集不同健康人的外周血，离心后收集血清，分别与不同终浓度的atraseB预孵育不同的时间。预孵育过的血清再与iPECs孵育。通过流式细胞术检测iPECs的死亡率和异种天然抗体IgG、IgM以及部分补体裂解片段C3c、C4c、C5b-9在iPECs表面的沉积水平；同时采用细胞免疫荧光技术进行同样的检测以验证得到的结果。 【结果】低剂量atraseB预处理对人血清杀伤iPECs略有抑制作用。当预处理使用的atraseB的浓度提高到7μM时，iPECs细胞死亡的比例大幅减少,逐渐接近阴性对照水平。进一步增加atraseB的浓度并没有明显增强这种抑制作用。血清和终浓度为10μM的atraseB预孵育时间在0-2h时，随着孵育时间的延长，抑制血清的杀伤作用越来越明显。血清和终浓度为10μM的atraseB预孵育2h后，流式细胞术检测其靶细胞表面C5b-9的沉积(Gmean值)较阳性对照组明显降低，细胞免疫荧光检测结果也显示出同样的趋势。无论是否与atraseB孵育，流式细胞术及免疫荧光技术检测C3c、C4c和异种抗体IgG、IgM在靶细胞表面沉积均没有明显的统计学差异。 【结论】1、AtraseB以浓度及时间依赖的方式抑制人血清对iPECs的杀伤作用；2、该抑制作用主要是通过抑制C5b-9在靶细胞表面沉积的水平上来实现的；3、AtraseB有可能作为一种有效的补体抑制剂应用到猪-人异种移植中。 第二部分AtraseB延长豚鼠到大鼠异种心脏移植物的存活时间 【目的】研究大鼠静脉注射atraseB后，其血液中补体活性及凝血功能的改变。利用豚鼠到大鼠腹腔异位心脏移植模型，研究atraseB在异种移植中是否有作用及其作用机制。 【方法】1.将20只Wistar雄性大鼠随机分为对照组(PBS组)和AtraseB给药组(3， 6 ，12 mg/kg)，每组5只。给药组尾静脉注射不同剂量的atraseB，对照组尾静脉注射等体积的PBS。注射药物2h后，从腹腔下腔静脉取血，分离血浆和血清。血浆用来测定凝血功能，血清用来检测补体活性。2.将21只受体大鼠随机分为4组:(1)正常组(n=6)：正常大鼠未做特殊处理；(2)对照组(n=6):大鼠静脉注射同等剂量的PBS2h后行心脏移植术；(3)AtraseB组(n=6):大鼠静脉注射单剂量的atraseB2h后行心脏移植术；(4)AtraseB7min组(n=3):大鼠静脉注射单剂量的atraseB2h后行心脏移植术，再灌注7min后处死大鼠(由于对照组平均心脏跳动时间为7min左右)。腹腔内异位豚鼠到大鼠心脏移植采用先前报道的方法(Qian-Yun Sun，Toxicon, 2003)。心脏停搏后处死大鼠，取血样离心后分离血清；取下移植物组织，部分直接冻存于-80℃冰箱，另外一部分用10%中性福尔马林缓冲液固定，进行后续病理检测。 【结果】1.AtraseB预处理2h后，它以剂量依赖的方式显著抑制了大鼠体内补体活性和凝血活性。特别是高剂量组几乎完全抑制了补体活性。2.与PBS组相比，atraseB治疗显著延长了移植物的存活时间，减轻了病理损伤，减少了血小板微血栓的形成以及纤维蛋白和C5b-9的沉积。 【结论】1、AtraseB预处理大鼠后，大鼠血液中补体活性及凝血功能均受到抑制，其中以凝血功能抑制效果更加显著；2、AtraseB可以延长豚鼠到大鼠心脏移植物存活时间以及减轻移植物的病理损伤；3、AtraseB主要是通过其抑制补体和凝血活性来延迟豚鼠到大鼠心脏移植中超急性排斥反应的发生。 第三部分AtraseB对小鼠肾脏缺血再灌注损伤的作用 【目的】探索atraseB对小鼠肾缺血再灌注损伤的作用及机制。 【方法】选取体重在22-25g的雄性C57小鼠，建立可逆性肾脏缺血再灌注模型，通过检测小鼠血清肌酐和尿素氮水平来评价atraseB的效果；通过对造模后肾组织进行HE染色及免疫组化来评价肾脏组织的病理改变以及补体的沉积情况；通过RT-PCR对炎症因子表达的检测评价组织中的炎症反应。实验分组为：(1)PBS组：小鼠注射PBS后行开腹操作，除不夹闭肾门外，其余操作与IRI组相同；(2)IRI组：小鼠采用缺血28min再灌注24h方式建立可逆性缺血再灌注损伤模型；(3)AtraseB组：小鼠静脉注射单剂量atraseB后12h建立可逆性缺血再灌注损伤模型。 【结果】IRI组术后24h取标本测得血肌酐在100μmol/L左右，符合可逆性缺血再灌注损伤模型特点。AtraseB预处理后血肌酐和尿素氮相较于IRI组有显著性下降。AtraseB的肾脏组织HE染色发现相较于IRI组，其细胞坏死、细胞核碎裂或者消失以及炎性细胞浸润情况均有好转，补体C5b-9在肾组织中的沉积较IRI组也明显减少。AtraseB组中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及趋化因子MCP-1、KC、MIP-1的mRNA表达水平与IRI组相比也有明显下降； 【结论】1、AtraseB对小鼠肾脏可逆性缺血再灌注损伤有保护作用；2、AtraseB的保护作用主要是依靠其抑制补体C5b-9的形成来实现的。3、AtraseB可以减少移植器官获取和保存过程的损伤，使移植物在受者体内快速恢复功能。
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