摘要
目的：肝移植是当前唯一有效的治疗终末肝病的手段。但是，由于肝脏供体来源紧缺、移植费用高昂等原因，绝大多数终末期肝病患者没有机会进行肝移植治疗。我们亟需寻找一种适合广泛推行的新的治疗方式。前期北大医学部发表的文章表明，人诱导多潜能干细胞（human induced pluripotent stem cell,hiPSC）来源的肝细胞可以作为生物人工肝的种子细胞来治疗动物模型的急性肝衰竭。这种肝细胞按照其分化的过程可以分为能够在体外大量增殖的前体细胞（progenitor cells）阶段和具有成熟功能的成熟肝细胞（mature hepatocytes）阶段。目前已证实成熟阶段的肝细胞可以应用于体外生物人工肝系统，成功救治药物诱导的急性肝衰竭猪。但是该方法需要在体外实现大量的细胞培养并诱导其成熟，而干细胞医学理想的目标是实现细胞在体内的定植扩增以及分化成熟；同时，随着生物打印技术的日益发展，体外立体培养也为干细胞研究转化为临床应用构建了崭新的平台。因此，我们希望通过比较不同生物打印材料作为支架下人诱导多潜能干细胞来源的肝脏前体细胞在体外立体培养生长情况，了解不同材料对细胞的不同影响，同时利用细胞片（cell sheet）技术将肝前体细胞移植于肝损伤小鼠模型，来了解细胞是否能在体内存活和发挥作用，为以后进一步探索肝脏前体细胞在体内定植、生长和分化铺好基石。 方法：我们将传代稳定的人多潜能干细胞来源的肝前体细胞，分别通过基质胶（Matrigel）、甲基丙烯酸酐化明胶（GelMa）、海藻酸明胶（ALG）三种材料进行体外立体培养，在培养的第1-7天对其形成的结构体进行细胞活性检测、免疫荧光染色、细胞活死染色以及相关基因的实时荧光定量PCR（qPCR），观察对比不同立体培养环境下肝细胞的特征变化。另外，我们还通过细胞片技术将肝前体细胞制备成细胞片，选择Fah-/-小鼠作为肝衰竭小鼠的疾病模型，通过撤药实验初步了解该细胞片在小鼠体内的作用，观察小鼠的生存情况以及小鼠体重、肝功能的变化。 结果：①人诱导多潜能干细胞来源的肝前体细胞可以在Matrigel材料的离体培养保持较高的生长速率，但细胞在培养途中很容易突破立体边缘而出现细胞贴壁生长。②Alginate和GelMa作为两种新型水凝胶的3D打印材料，可以和Matrigel一样保持较好的细胞活性和功能。而GelMa操作更加简单，更适合未来3D打印的需求。③细胞片技术可以将肝前体细胞移植在小鼠肝脏表面，减轻Fah-/-小鼠肝损伤，延长Fah-/-小鼠的生存时间。 结论：本研究证实了人诱导多潜能干细胞来源的肝细胞的前体细胞在不同生物材料体外立体培养的稳定性，同时该细胞可以在肝衰小鼠体内存活，提高肝衰小鼠生存并改善肝功能。本研究为人多潜能干细胞来源的肝脏前体细胞在体内的研究提供了一定的思路，为未来研究多潜能干细胞在体内的定植提供了技术支持。
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