摘要
异常的WNT信号传导与胃溃疡和黑色素瘤等多种疾病密切相关，因此寻找WNT通路调节剂则成为治疗WNT信号相关疾病的重要手段。植物多酚具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗肿瘤和增强免疫力等多种生理活性，多酚类物质已经成为开发WNT信号调节小分子化合物的研究热点。本论文从26种植物中筛选出具有良好WNT信号抑制活性的枳实和桂枝两种原料。其中，枳实是国家食品药品监督管理总局批准使用的保健食品原料，桂枝则为日常饮食中常用的香料，枳实和桂枝中都含有丰富的多酚类物质，可作为保健食品原料进行研究。 利用体积分数为75%乙醇从高良姜、茯苓、白扁豆、黄芪、吴茱萸、豆蔻、桂枝、郁金、白芷、枳实、白术、佛手、姜半夏、石斛、广藿香、甘草、人参、当归、麦冬、木香、柴胡、砂仁、陈皮、党参、白芍、干姜26种植物原料中提取出多酚粗提物，并通过Folin–Ciocalteu测定其多酚含量。HEK293-TOPflash双荧光素酶报告基因细胞模型可表征WNT信号处于激活或抑制状态。首先通过MTT法，测定不同植物多酚提取物对于HEK293-TOPflash细胞的最大无毒性作用浓度。HEK293-TOPflash细胞中添加WNT3A条件培养基进行刺激，导致WNT信号强度增加，其荧光素酶反应强度值为123.33±21.72；然而添加含有5.00μg/mL枳实和25.00μg/mL桂枝多酚提取物的WNT3A条件培养基刺激，其荧光素酶反应强度值分别降低至39.56±14.42(p<0.01)和2.41±1.03(p<0.001)，说明枳实和桂枝多酚提取物具有较好的体外WNT信号抑制活性。其余24种植物多酚提取物无明显的WNT信号抑制活性。 采用无水乙醇灌胃构建急性胃溃疡大鼠模型，胃部直观图和HE染色结果都显示，与正常组相比无水乙醇造模组大鼠胃黏膜严重受损，表明WNT通路激活的胃黏膜损伤大鼠模型构建成功。通过比较胃部直观图发现，枳实、桂枝多酚提取物预处理对于受损伤胃黏膜的保护效果好，具体表现为出血点减少，与阳性对照药物处理效果无明显差异(p>0.05)，表明枳实、桂枝多酚提取物在无水乙醇诱导的大鼠胃溃疡模型中具有良好的保护作用。胃部HE染色图损伤抑制率的统计显示，提前灌胃阳性对照、枳实和桂枝多酚提取物能够分别提高的大鼠损伤抑制率为35.29±22.01%(p<0.05)、23.53±35.29%(p<0.05)和15.77±26.64%(p<0.05)。结果表明枳实多酚提取物和桂枝多酚提取物预处理能保护无水乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤，但是枳实多酚提取物的保护效果优于桂枝多酚提取物。 采用腹股沟皮下注射B16细胞构建C57BL/6黑色素瘤小鼠模型，一周后于注射部位长出原位黑色素瘤，未接受B16细胞注射的正常对照组小鼠则无肿瘤出现，表明WNT通路激活的黑色素瘤小鼠模型构建成功。通过比较不同组别小鼠肿瘤尺寸，发现模型组小鼠肿瘤尺寸平均值为1614.89±170.08mm3，注射达卡巴嗪组小鼠肿瘤尺寸平均值为977.92±18.61mm3(p<0.05)，枳实多酚Ⅱ组小鼠能够达到与每天注射达卡巴嗪相似的结果，其肿瘤平均尺寸为881.52±35.94mm3(p<0.05)，桂枝多酚Ⅱ组小鼠肿瘤平均尺寸为1147.41±66.60mm3，与模型组相比不显著(p>0.05)，肿瘤尺寸数据表明枳实多酚提取物对肿瘤抑制效果优于桂枝多酚提取物。肿瘤HE染色结果显示：枳实多酚提取物联合达卡巴嗪作为抗黑色素瘤辅助物，能够抑制黑色素瘤的生长，具体表现为肿瘤细胞出现核固缩，黑色素沉积等。结果表明枳实多酚提取物联合达卡巴嗪给药对肿瘤的抑制效果显著，与阳性药物抑制效果相比无显著性差异(p>0.05)，然而桂枝多酚提取物联合达卡巴嗪用药则对肿瘤的抑制效果不显著，说明在B16黑色素瘤小鼠模型中，枳实多酚提取物具有更好的体内生物活性。 通过比较四种大孔树脂对枳实多酚的静态吸附与解吸效果，筛选出吸附与解吸效果均较好的弱极性树脂AB-8。本实验采用单因素优化实验考察不同料液比、乙醇浓度、时间和温度对枳实多酚提取率的影响。筛选出枳实多酚提取参数为：料液比1:10，乙醇体积分数75%，提取时间90min，提取温度为35℃。采用柱层析法纯化枳实多酚时，利用体积分数为40%和60%乙醇洗脱分别得到组分ZS-1和ZS-2。125.00μg/mLZS-1能够使HCT116细胞增殖率从73.99±8.06%降低至44.21±11.15%(p<0.01)。通过UHPLC-Q-TOF/MS分析，从ZS-1中鉴定出68种化合物，其中命名为Unkown1-6的6种化合物是文献和数据库中未找到对比的未知化合物，值得进一步解析其具体结构。 综上所述，从26种植物原料中筛选出的枳实、桂枝多酚提取物能在体外抑制WNT3A条件培养基激活的WNT信号；然后通过乙醇诱导的胃溃疡大鼠和B16黑色素瘤小鼠，两种WNT信号通路激活的动物模型对枳实和桂枝多酚提取物进行体内生物活性评价，发现枳实多酚提取物胃黏膜保护效果和抗肿瘤效果皆优于桂枝多酚提取物。通过单因素实验筛选出纯化多酚的最适条件参数和大孔树脂种类，探究纯化枳实和桂枝多酚的体外WNT信号抑制活性及对WNT依赖的HCT116肿瘤细胞的增殖抑制效果，结果表明纯化后的枳实多酚比桂枝多酚具有更好的肿瘤增殖抑制活性，随后利用UHPLC-Q-TOF/MS分析枳实纯化多酚组分ZS-1，解析出枳实多酚中具有体内外WNT信号通路抑制活性的具体化合物组成。上述结果揭示枳实多酚因其良好的体内外WNT信号抑制活性有望作为胃黏膜保护和辅助抑制黑色素瘤功能食品或特殊医用食品配料，在WNT信号通路相关疾病保护方面具有良好的应用前景。
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