摘要
弓形虫是一种专性的胞内寄生原虫，主要感染包括人类在内的所有温血动物，导致流产、死胎等严重危害。弓形虫具有复杂的生活史，包括在终末宿主猫体内的有性繁殖和中间宿主体内的无性繁殖阶段，无性繁殖阶段又包括急性感染期虫体快速繁殖的速殖子阶段和慢性感染期的缓殖子阶段。不同阶段的虫体具有不同的生物学特征，它们在虫体传播和致病过程中扮演了关键的角色，但是我们对虫体由一个阶段分化到另一个阶段的分子调控作用还知之甚少。实验室前期通过核蛋白组学技术筛选到两个在速殖子与缓殖子期丰度有差异的转录因子，AP2X-4及AP2XII-5。本研究围绕这两个蛋白的功能开展研究，以了解它们对虫体生长发育的调控作用，具体工作包括以下两个方面： (1)AP2XII-5对生活史中各个阶段基因表达的调控作用 实验室前期已经在II型虫株ME49中构建了AP2XII-5的缺失株。本研究首先获得了AP2XII-5的特异性抗体并验证了AP2XII-5缺失株的有效性。此外，对Δap2XII-5虫株进行RNA-seq分析发现，AP2XII-5的缺失导致虫体阶段特异性基因表达紊乱，基因的表达紊乱导致弓形虫毒力下降及缓殖子复制能力减弱。DNA结合实验证明AP2XII-5的AP2功能域能够与缓殖子时期特异表达的乳酸脱氢酶2(LDH2)的启动子序列特异性结合。这些结果表明AP2XII-5转录因子可通过与目标基因启动子结合来调控弓形虫生活史各阶段基因的有序表达从而影响虫株毒力。 (2)AP2X-4对棒状体分泌蛋白表达的调控作用 AP2X-4在缓殖子时期的转录水平高于速殖子时期，因此我们猜测它可能调控缓殖子的分化发育，但遗传学研究表明它对弓形虫速殖子的生长非常重要。在II型虫株ME49中敲除AP2X-4，体外表型实验发现缺失AP2X-4后，虫体的入侵和生长受到明显影响。RNA-seq表明AP2X-4的缺失影响棒状体分泌蛋白的表达，其中包括一些如RON4、RON5等虫体入侵宿主细胞的关键蛋白。此外，AP2X-4还调节慢性感染期特异性表达的基因，例如BAG1和LDH2。鉴于AP2X-4对入侵和缓殖子分化相关基因的调节作用，它的失活导致了弓形虫毒力的急剧减弱及脑包囊形成缺陷。 弓形虫基因组编码67个AP2转录因子，本研究通过对AP2XII-5和AP2X-4的分析发现AP2转录因子对虫体的生命活动有广泛的调节作用，且不同的转录因子有不同的调控目标，AP2XII-5抑制有性生殖阶段特异性基因在速殖子时期的表达，进而影响虫株的毒力。AP2X-4则主要通过调节棒状体分泌蛋白的表达来调控虫体对宿主细胞的入侵，从而影响虫体的生长和毒力。
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