摘要
葡萄是世界上具有重要经济价值的栽培果树，国内外广泛种植的品种主要为欧洲葡萄，欧洲葡萄果实品质优良，而且加工产品丰富，其缺点是抗病性差，易受葡萄白粉病等真菌病害的影响。葡萄白粉病是一种生物营养型真菌，能侵染葡萄所有绿色组织，导致葡萄果实品质下降和产量降低。挖掘葡萄抗病基因，通过转基因技术来培育抗病性强、品质优良的葡萄新品种具有重要意义。课题组前期对葡萄WRKY转录因子进行了生物信息学分析以及抗病和感病葡萄在不同病原菌诱导下的差异基因表达分析，筛选出了白粉菌诱导显著差异表达的VqWRKY56基因。本研究在此基础上，从抗白粉病的中国野生毛葡萄‘商-24’中克隆VqWRKY56基因，利用农杆菌介导法转化易感病的欧洲葡萄无核白，开展VqWRKY56基因功能及其作用机制研究。主要研究结果如下： 1.中国野生毛葡萄VqWRKY56基因克隆及其序列分析。VqWRKY56在抗病毛葡萄‘商-24’接种白粉菌后的表达分析结果表明，白粉菌诱导VqWRKY56基因显著上调表达，并在120h时表达量最大；利用同源序列克隆得到VqWRKY56开放阅读框，长度为1491bp，编码496个氨基酸残基；VqWRKY56cDNA序列与葡萄基因组数据库中欧洲葡萄‘黑比诺’的序列相似性为98.93％，氨基酸的同源相似性为98.99％，该基因属于WRKY转录因子IIb组成员，含有一个WRKY保守结构域。VqWRKY56基因具有6个外显子，5个内含子。蛋白质二级结构预测结果表明，VqWRKY56基因所编码蛋白含有3个折叠和14个螺旋，其氨基酸序列不具有信号肽。 2.中国野生毛葡萄VqWRKY56基因抗白粉病功能分析。构建了pCAMBIA2300-35s-VqWRKY56-3Xflg植物过表达载体，并对欧洲葡萄无核白的花药器官进行诱导，成功获得了胚性愈伤组织；利用农杆菌介导法将VqWRKY56植物过表达载体转化无核白胚性愈伤组织，共得到9株抗性苗，经半定量PCR和实时荧光定量PCR鉴定共得到8株阳性株系；对过表达株系和野生型(WT)接种了葡萄白粉菌处理，发现野生型的发病面积显著大于过表达株系；组织化学染色发现，过表达株系与野生型(WT)相比发现了大量的细胞死亡和活性氧(ROS)的积累，且活性氧(ROS)的积累与细胞死亡呈正相关，表明VqWRKY56基因可能通过调控白粉菌诱导的过敏反应(HR)来提高对白粉菌的抗性。接种白粉菌后转基因株系与野生型(WT)相比SA途径防御相关基因被显著诱导上调表达，这暗示VqWRKY56可能通过正向调控SA信号途径来提高对白粉菌的抗性。
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