摘要
本论文系统开展了传统中药吴茱萸化学成分的肠内菌代谢、吸收及分布研究，观察了对小鼠阿尔茨海默症模型的影响，获得如下结果： 1.将吴茱萸醇提取物与健康志愿者肠内菌进行共培养，经过富集、分离、纯化，得到14个化合物，经结构鉴定，化合物分别为β-谷甾醇、槲皮素、吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[(Z)-6-十一烯基]-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[4,7-十三二烯基]-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-十一烷基-4(1H)-喹诺酮、吴茱萸卡品碱、1-甲基-2-[十五二烯基]-4(1H)-喹诺酮、二氢吴茱萸卡品碱、1甲基-2-[十五烯基]-4(1H)-喹诺酮。提示上述化合物在模拟人体肠道环境下能保持结构稳定，可作为吴茱萸提取体内代谢研究标志物的参考。 2.从上述14个肠内代谢稳定的化合物中选取9个，另外增加吴茱萸酰胺Ⅰ及吴茱萸酰胺Ⅲ两个生物碱成分作为研究目标，跟踪其在血液及脏器组织中的吸收、分布过程，并利用UPLC-MS建立了能同时测定11种化合物生物样品的快速、准确分析方法。 血浆药-时曲线的研究表明，大鼠灌胃给予吴茱萸醇提物后，被胃肠道迅速吸收，给药后10min均可测得血清中药物浓度，多数药物血药浓度在2h达峰值，少数化合物如二氢吴茱萸卡品碱和吴茱萸酰胺Ⅲ达峰时间分别约为360min和180min。给药后，消除迅速，除吴茱萸次碱外，其他药物的平均血清半衰期(t1/2)为1-3h，直接反映了吴茱萸成分的体内消除过程。 去氢吴茱萸碱，二氢吴茱萸卡品碱，1-甲基-2-[十五二烯基]-4(1H)-喹诺酮，1-甲基-2-[十五烯基]-4(1H)-喹诺酮，吴茱萸碱，吴茱萸卡品碱，1-甲基-2-壬基-4(1H)-喹诺酮暴露量较高，AUC范围为2937.631~16514.501h*ng/mL。而1-甲基-2-[Z-6-十一烯基]-4(1H)-喹诺酮，吴茱萸次碱，吴茱萸酰胺Ⅰ，吴茱萸酰胺Ⅲ暴露量较低，AUC范围为565.001~1819.277h*ng/mL。 组织分布研究表明，大鼠灌胃给予吴茱萸醇提物后，各组织中的化合物分布量随时间变化呈动态分布，在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、睾丸和肌肉组织中，均未见明显的蓄积现象。灌胃给药后60min，药物可分布至大多数组织，以胃肠道的含量最高，可能与口服给药方式有关。大部分血流较丰富的组织如肺、肾脏、肝脏，在给药60～120min后药物浓度达到高峰，然后开始逐渐下降，其浓度变化趋势与药物在血中的清除过程基本同步，表明吴茱萸生物碱的组织分布是一个与血流灌注有密切关联的过程。去氢吴茱萸碱、吴茱萸卡品碱、二氢吴茱萸卡品碱、1-甲基-2-[Z-6-十一烯基]-4(1H)-喹诺酮、1-甲基-2-[十五二烯基]-4(1H)-喹诺酮，1-甲基-2-[十五烯基]-4(1H)-喹诺酮在肾脏中均有较高的分布，提示可能以原型经肾排泄。吴茱萸醇提取物中含量较高的三种生物碱—吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱和吴茱萸次碱在脑组织中均有分布。 3.将吴茱萸提取物中吸收入血的10个生物碱与胆碱酯酶进行柔性分子对接，分析构效关系，并根据药代动力学参数及入血小分子生物碱-靶点对接的复合物结构进行结合模式分析，获得具有胆碱酯酶抑制剂作用的吴茱萸小分子生物碱。通过分子对接软件Vina对入血的10个生物碱进行分子对接，发现其中活性最高的四个化合物是吲哚型生物碱去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸酰胺I，他们与乙酰胆碱酯酶的对接打分均在-11kcal/mol以下，且与盐酸多奈哌齐结合指数比较结果接近；与丁酰胆碱脂酶对接打分均在-10kcal/mol以下。说明吴茱萸提取物中的去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸酰胺I均与胆碱酯酶具有较好的结合能力，且明确其主要构效关系。 4.以去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸碱、吴茱萸醇提取物作为考察目标开展体外乙酰胆碱酯酶的抑制活性验证，结果在不同剂量组，去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸碱、吴茱萸醇提取物均具有AchE抑制作用，当给药浓度为500?g/ml时，去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸碱的抑制率均大于65%，吴茱萸醇提取物的抑制率约为45.6%，验证了分子对接结果。 5.采用腹腔注射D-半乳糖和亚硝酸钠建立BALB/c小鼠阿尔茨海默症模型，给药6周后进行了动物行为学(水迷宫)实验，定位巡航及空间探索试验结果表明，吴茱萸醇提物、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱均可改善阿尔茨海默病小鼠学习认知功能，去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱为吴茱萸醇提物改善阿尔茨海默病小鼠学习认知功能的主要药效物质，二者分别单独给药效果低于醇提物，推测可能为此二种药效物质协同或与其他药效成分协同作用结果。本实验测定了血清中SOD活性、MDA含量，脑组织中AchE活性，结果表明吴茱萸醇提物、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱在一定的浓度下均可使血清中SOD活性升高，MDA含量降低，脑组织中AchE活性降低，推测其作用机制可能与氧化应激及胆碱能系统调控相关，有待进一步探讨。 6.本文利用网络药理学研究方法，建立吴茱萸化学成分与阿尔茨海默症治病靶点之间连接桥梁，预测吴茱萸对阿尔茨海默症的治疗作用及可能的机制。结果为吴茱萸碱、吴茱萸新碱、去氢吴茱萸碱、α-蛇麻烯、丁香酚、吴茱萸次碱、异鼠李素、β-谷甾醇、芦丁、咖啡因、己醛、棕榈酸、槲皮素、齐墩果酸等14个化学成分可直接或间接作用于疾病的16个靶点。其中APOE、PTPRC、GSK3B、CDK5等疾病靶点与化学成分靶点关联度较强，他们分别影响着脑内胆固醇代谢异常、β-淀粉样蛋白沉积、小鼠神经元的损失、tau蛋白异常磷酸化等。后续研究可重点分析以上成分及靶点的相关性。 综合分析网络中的43个疾病靶点、成分靶点和其他蛋白涉及到的信号通路，吴茱萸作用于阿尔茨海默症的主要机制为吴茱萸化学成分作用于神经元凋亡、突触传递、一氧化氮生物合成、轴突再生、MAPK、Wnt等通路。神经元凋亡、一氧化氮生物合成均与氧化应激相关，突触传递与胆碱酯酶活性相关，这与前文推测相一致。
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