摘要
【目的】 1.研究在乙肝疫苗免疫应答的过程中，Tfh细胞、其他辅助性T细胞(Th细胞)、调控性T细胞(Treg细胞)、B细胞及其亚群的动态变化，明确Tfh细胞在乙肝疫苗免疫应答中的主要作用以及与其他Th细胞、Treg细胞及其亚群的相互作用。 2.研究关键性转录因子GATA3、ROR-γ、Foxp3、Bcl-6和T-bet，细胞因子IL-4,IL-17,IL-21和IFN-γ在乙肝疫苗过程中的动态变化，分析它们与Tfh细胞的关联。 【方法】 1.2只8-10周龄雌性C57BL/6小鼠被随机分配到4组，每组18只。空白组不作任何处理，乙肝疫苗组腹腔注射1.0μg乙肝疫苗，免疫对照组腹腔注射2×108绵羊红细胞，PBS对照组腹腔注射等量的PBS。分别于注射后的3天，7天，14天取脾脏、淋巴结、眼球血做进一步实验。 2.所取的脾脏1/3研磨，制备单细胞悬液，采用流式细胞术检测Tfh细胞，Th细胞、Treg细胞、B细胞及各自亚群的表达水平。 3.所取的脾脏2/3研磨，制备单细胞悬液，采用磁珠分选法分选出CD4+T细胞，荧光定量PCR检测转录因子Bcl-6,Foxp3,GATA3,ROR-γ和T-bet的表达水平,蛋白免疫印迹定量定性地检测蛋白Bcl-6,Foxp3,GATA3,ROR-γ和T-bet的表达。 4.采集淋巴结，用免疫荧光组织化学方法检测Tfh(CD4+CXCR5+T)细胞的表达。 5.采集眼球血，分离血清，采用酶联免疫分析(ELISA)检测乙肝表面抗体(HBsAb)以及细胞因子IL-4、IL-17、IL-21、IFN-γ的表达水平。 【结果】 1.乙肝疫苗免疫应答过程中Tfh细胞及其亚群Tfh1、Th2和Th17细胞表达的变化 在乙肝疫苗组接种后，HBsAb水平在第7天最高且与其他时间点的表达差异具有统计学意义(P＜0.0001)。Tfh细胞的表达呈现先上升后下降的趋势，在第7天的表达最高且与其他时间点的表达差异具有统计学意义(P=0.003)。Tfh细胞在淋巴结中存在并且在接种后第7天高表达(P<0.0001)。Tfh1、Tfh2、Tfh17细胞均呈现先上升后下降的趋势，Tfh1、Tfh2细胞在第7天与其他时间点的表达差异均具有统计学意义(P=0.006，P＜0.0001)。相关性分析发现，浆细胞与Tfh细胞呈正相关(P＜0.0001)，HBsAb与Tfh细胞呈正相关(P＜0.0001)。B细胞与Tfh1及Tfh2细胞两者均存在正相关性，而B细胞与Tfh17细胞无相关性。在接种后第7天，B细胞及浆细胞两者与Tfh细胞均有关联(P=0.054，P=0.001)；在第14天，记忆性B细胞与Tfh细胞正相关(P＜0.0001)。在接种后第7天，B细胞、浆细胞两者与HBsAb均有相关性(P=0.039，P=0.0122)。 2.乙肝疫苗免疫应答过程中总Th细胞、调节性T细胞(Treg细胞)及其亚群表达的变化 总Th细胞在三组间的表达差异有统计学意义(P=0.002)。在乙肝疫苗接种后，总Th细胞呈现上升趋势，在14天达到高峰(P=0.001)。Th1、Th2和Th17细胞的表达均呈现上升趋势，在不同时间点的表达差异均具有统计学意义(P均＜0.0001)。相关性分析发现，B细胞、浆细胞两者与总Th细胞均存在相关性(P=0.0078；P=0.0043)；然而记忆性B细胞与总Th细胞无相关性(P＞0.05)。HBsAb与Th1、Th2和Th17细胞三者均无相关性(P＞0.05)。浆细胞与Th2和Th17细胞两者均呈正相关(P=0.0173，P=0.0034)。其中，在接种后第3天，浆细胞与Th2细胞呈现正相关(P=0.047)；在第7天，B细胞与Th2细胞，浆细胞与Th17细均呈现正相关(P=0.047；P=0.0113)。此外，Th2及Th17细胞两者与Tfh细胞均正相关(P=0.0002；P=0.0129)。 Treg细胞在第7天高表达(P＜0.0001)，Tfr细胞在第14天高表达(P=0.002)。相关性分析发现，在接种后第7天，Treg细胞与Tfh细胞呈现负相关(P=0.0122)；在第14天，Tfr细胞与Tfh细胞负相关(P＜0.0001)。在乙肝疫苗组，Treg细胞与Tfr细胞正相关(P=0.0031)。此外，在接种后第14天，B细胞、浆细胞两者与Tfr细胞均呈负相关(P=0.0075；P=0.0393)。 3.乙肝疫苗免疫应答过程中转录因子Bcl-6、Foxp3、GATA3、ROR-γ和T-bet及蛋白的表达变化 通过免疫对照组、乙肝疫苗组及PBS组的比较，三组间Bcl-6、GATA3及ROR-γ的表达差异均有统计学差异(P=0.0003；P=0.045；P=0.021)。乙肝疫苗组中，Bcl6、GATA3及ROR-γ三者分别在不同时间的表达差异均具有统计学意义(P均＜0.05)。Bcl6、GATA3及ROR-γ分别在接种后第7、14天，三者均在这两个时间点相对其他时间点的表达差异均有统计学意义。在接种后第7、14天，Bcl6与Tfh细胞在这两个时间点两者均呈正相关(P=0.024；P=0.0001)。在接种后第7、14天，GATA3与Tfh细胞在这两个时间点两者间均呈正相关(P=0.035；P=0.015)。在接种后第7天，ROR-γ与Tfh细胞正相关(P＜0.0001)。在蛋白表达水平上，乙肝疫苗接种后，Bcl-6、T-bet、ROR-γ均有高表达。 4.乙肝疫苗免疫应答过程中细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17和IL-21表达的变化及相关性分析 乙肝疫苗接种后，细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-21四者分别在不同时间点的表达差异均具有统计学意义。IL-21与Tfh细胞呈正相关(P＜0.0001)，而其他三者与Tfh细胞均无相关性(P＞0.05)。此外，IFN-γ的表达与Th1细胞呈正相关(P=0.0141)；IL-4与Th2细胞呈正相关(P=0.0141)；IL-17与Th17细胞呈正相关(P=0.0141)。此外，IL-21与Tfh2细胞呈正相关(P=0.0141)。 【结论】 1.Tfh细胞是参与乙肝疫苗免疫应答的主要Th细胞亚群。 2.在乙肝疫苗免疫应答的过程中，Th2及Th17细胞，Treg细胞及亚群参与该过程并与Tfh细胞的表达相关。 3.在乙肝疫苗免疫应答的过程中，Tfh细胞经过转录因子、细胞因子的参与，其具体的相互作用网络需进一步的研究和论证。
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