摘要
南极磷虾资源蕴藏量巨大，生物量多达6.5-10.0亿吨，其作为潜在优质的动物蛋白源对缓解人类食物短缺具有重要应用前景。南极磷虾活体氟含量高，分布不均匀，99%主要集中于虾壳，肌肉中含量少。南极磷虾死后贮藏过程中，伴随着虾体自溶，虾壳中的氟以游离形态向虾肉发生迁移，造成虾肉氟污染而不能安全食用。高氟是限制南极磷虾开发利用的瓶颈之一，阐明南极磷虾壳中氟的赋存形态及其释放游离氟的机制，可以从源头固氟，阻隔氟的迁移，有效抑制虾肉氟含量的升高，对促进南极磷虾资源的开发利用具有重大的理论价值和现实意义。 本论文首先对南极磷虾壳的微观结构及其氟赋存形态进行分析，然后对南极磷虾壳释放游离态氟的诱发因素进行筛选与甄别，筛选出了内源水解酶中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)和类胰蛋白酶是引起虾壳释放游离氟的主要潜在诱发因素，随后对NAGase和类胰蛋白酶进行分离纯化，并对其酶学特性进行研究，最后对NAGase和类胰蛋白酶引起南极磷虾壳释放游离氟的规律进行研究。主要研究内容与结果如下： 1、利用扫描电子显微镜(SEM)对南极磷虾壳的微观结构进行观察，通过核磁共振(NMR)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)和能谱分析(EDS)等多种分析手段对南极磷虾壳中有机态氟、无机结合态氟进行表征，在此基础上对南极磷虾壳中的氟进行分类。结果表明：(1)南极磷虾壳的化学成分主要为蛋白质、甲壳素及无机盐；南极磷虾壳呈典型的分层结构，外层致密，内层疏松，α晶型的甲壳素纤维从分布在其中的孔道内伸出并扩展成层，多层堆叠构成虾壳的主体结构，甲壳素纤维上有结点，无机盐沉积在甲壳素纤维束上，蛋白质包裹在甲壳素纤维和无机盐表面并将其粘结在一起最终形成虾壳；(2)南极磷虾壳无机盐中无机结合态氟为氟磷灰石，不含其它无机氟化物；虾壳中不含有机氟化物，但含有弱结合态氟有机氟；(3)南极磷虾壳中的氟可分为游离态氟和结合态氟，其中结合态氟包括氟磷灰石形式存在的氟及与甲壳素、蛋白质等大分子以弱结合态存在的氟。南极磷虾壳总氟含量为3140±86ppm，其中：游离氟含量为722±35ppm，占总氟的23.0%，氟磷灰石形式氟含量为1272±44ppm，占总氟的40.5%，甲壳素、蛋白质等大分子结合态氟含量1146±8ppm，占总氟的36.5%。 2、以虾壳游离氟释放量为主要考察指标，研究南极磷虾pH、微生物和内源酶对虾壳释放游离氟的影响，筛选与甄别南极磷虾壳释放游离氟的主要诱发因素。结果表明：南极磷虾在10℃贮藏24h，pH由7.42升高到7.95，该pH范围内虾壳游离氟释放量维持不变，南极磷虾-30℃冻藏7个月，菌落总数不变，虾壳游离氟释放量由156.2μg/g升高到220.5μg/g，所以pH和微生物不是引起虾壳释放游离氟的重要因素；南极磷虾壳在NAGase、类胰蛋白酶和碱性磷酸酶(ALP)粗酶液中20℃反应10h，虾壳游离氟释放量分别由35.0μg/g增加到58.7μg/g、27.0μg/g增加到48.9μg/g、29.0μg/g增加到37.5μg/g，增加量分别23.7、21.9和8.5μg/g，NAGase和类胰蛋白酶粗酶液能够促进虾壳释放游离氟，因此NAGase和类胰蛋白酶是引起虾壳释放游离氟的主要潜在诱发因素。 3、运用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析等方法对南极磷虾NAGase进行分离、纯化，应用凝胶电泳(SDS-PAGE)对其纯度与分子量进行检验，采用MALDI-TOF-MS对纯化酶进行鉴定，对其酶学性质进行研究。结果表明：NAGase的纯化倍数为102.94，得率16.11%，分子量为59.0kDa，肽段的氨基酸序列与凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的甲壳素酶前体(ACG60513.1)相近(蛋白质得分为132分)，表明纯化得到的酶为甲壳素水解酶。该NAGase最佳pH为6.5，pH5.0-6.0范围内稳定，最适反应温度为45℃，35℃以下具有良好的温度稳定性，Mg2+和Ca2+对NAGase有激活作用，酶动力学参数Km和Vmax分别为0.41mmol/L和2.66μmol/(min·mL)。 4、运用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶层析等方法对南极磷虾类胰蛋白酶进行分离、纯化，应用SDS-PAGE对其纯度与分子量进行检验，采用MALDI-TOF-MS对纯化酶进行鉴定，对其酶学性质进行研究。结果表明：类胰蛋白酶纯化倍数为26.97，得率9.32%，分子量为25.9kDa，肽段的氨基酸序列与南极磷虾类胰蛋白酶氨基酸序列相近(AOW41610.1)相近(蛋白质得分为126分)，表明纯化得到的为南极磷虾类胰蛋白酶。该类胰蛋白酶最佳pH为7.2，中性偏碱条件下稳定，最适反应温度为40℃，35℃以下具有良好的温度稳定性，Mg2+、Ca2+和Ba2+对类胰蛋白酶有激活作用，酶动力学参数Km和Vmax分别为0.31mmol/L和222μmol/(mL·min)。 5、研究NAGase和类胰蛋白酶诱发南极磷虾壳释放游离氟的动力学，跟踪监测虾壳微观结构变化与其释放游离态氟的关系，研究NAGase和类胰蛋白酶引起南极磷虾壳释放游离氟的机制。结果显示：NAGase和类胰蛋白酶引起虾壳释放游离氟的动力学方程分别为CW=[1?0.98e-0.0111t?0.02e0.15t]×175.52+10.80和CW=[1?0.97e?0.006t?0.03e0.0558t]×337.53+10.50。南极磷虾壳释放游离氟机制为：南极磷虾壳中的甲壳素与蛋白质在NAGase和类胰蛋白酶分别作用下发生降解，导致虾壳结构破坏，从而引起虾壳中氟由有机结合态转化为游离态。热处理钝化南极磷虾的内源酶，能阻断虾壳释放游离氟途径，有效抑制虾肉氟含量的升高。
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