摘要
漆树(Toxicodendronvernicifluum(Stokes)F.A.Barkl.)是我国最古老的经济树种之一，从其树皮割取的生漆是优良的天然涂料。由于气候水热条件限制和利用过度、保护不足，致使我国的漆树资源和生漆产量在不断减少。谷胱甘肽S-转移酶(GlutathioneS-transferases，GSTs，E.C.2.5.1.18)广泛存在于细胞质中，与植物抗逆性密切相关，在清除生物或非生物胁迫产生的氧化损伤中起着重要作用，所以研究漆树谷胱甘肽S-转移酶对揭示漆树抗逆机理具有非常重要的意义。 本研究以漆树主栽品种‘大红袍’为试验材料，以漆树谷胱甘肽S-转移酶为研究对象，在漆树转录组数据的基础上，初步筛选出38条GSTs基因，对其序列进行了分析，并对其中LambdaGST基因进行克隆、表达及其功能的研究，主要结果如下： 1．漆树GST基因家族分为φ(Phi，F)、τ(Tau，U)、θ(Theta，T)、ζ(Zeta， Z)、λ(Lambda，L)、脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbatereductase，DHAR)6个亚类；漆树TvGSTs基因序列的核苷酸长度主要集中在600~750bp；α-螺旋是漆树TvGSTs蛋白质二级结构的主要特征；漆树TvGSTs蛋白定位于分泌通路、线粒体、叶绿体和其它位置；不同漆树亚类TvGSTs基因GO功能注释在细胞学组件、生物学途径及分子功能存在较大的差异；漆树GST基因在不同组织中有明显的差异性表达。 2．克隆了漆树谷胱甘肽S-转移酶基因TvGST7(GenBank登录号为MK956145)的完整编码序列，开放阅读框为711bp，编码236个氨基酸，分子质量为27.17ku，理论等电点为5.25；无跨膜区域，属于胞质型GST；系统进化树分析和三维结构模拟表明，TvGST7蛋白属于Lambda(L)亚家族。qRT-PCR(实时荧光定量PCR)结果表明，TvGST7基因在漆树根、茎、叶中都有表达，在茎中的表达量最高。 3．将原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)，在正常条件下，BL21/pET28a-TvGST7和BL21/pET28a转化细胞的生长情况没有明显差异；经－20，50℃处理后，BL21/pET28a-TvGST7细胞的生长状态均优于BL21/pET28a；经500mmol/LNaCl处理，BL21/pET28a-TvGST7生长情况较好，而BL21/pET28a几乎不能生长；经1200mmol/L山梨醇处理，BL21/pET28a-TvGST7的生长情况要略好于BL21/pET28a。 4．利用原核表达系统和Ni-NTA亲和层析技术表达和纯化漆树LambdaGST重组蛋白，获得了27ku的可溶性蛋白，50mmol/L为咪唑洗脱液最佳洗脱浓度，蛋白质量浓度为130μg/mL，蛋白纯化后为单条带。TvGST7蛋白对底物DHA具有活性，比活力为(5.36±0.01)μmol/(min·mg)；TvGST7蛋白对底物HED具有微弱活性，比活力为(0.01±0.01)μmol/(min·mg)；而TvGST7蛋白对CDNB、DCNB、NBC及NBD-Cl均未检测到活性。 以上研究有助于了解LambdaGST在漆树代谢和抗逆中的作用，可为漆树抗逆育种提供分子生物学依据。
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