摘要
日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是中国沿海地区最具有经济价值的虾类之一。低盐和高亚硝酸盐氮是环境胁迫的两个重要因子，与虾类的生长、存活和免疫调节密切相关。研究低盐和高亚硝酸盐氮胁迫日本囊对虾的分子机制，为日本囊对虾的健康养殖提供重要理论依据。本研究对低盐和高亚硝酸盐氮胁迫下的日本囊对虾进行转录组分析，并筛选出一个与抗逆性密切相关的海藻糖6-磷酸合成酶(TPS)基因进行克隆，用RNA干扰技术对其抗逆和免疫功能进行初步的研究。主要研究结果如下： (1)低盐胁迫日本囊对虾转录组分析：在盐度为8的低盐胁迫下，分别于6、12、24、48和96h取日本囊对虾的肝胰腺以及对照组的肝胰腺进行转录组测序。我们获得88890960–105130044个CleanReads，数据量为6.68G-7.88G，G30为93.34-94.53%，利用Trinity组装后获得48807条unigenes，N50为1746bp。与对照组相比，分别得到811、589、1095、745和875个差异基因(DEGs)。我们对DEGs进行注释，得到与渗透调节、代谢和免疫相关的通路和基因。并通过qPCR对随机选择的9个基因(TauD、SarDH、CLEC、GNMT、BHMT、MAT2α、PPP2Cβ、TAUT和AGMAT)进行验证，其表达量与RNA-seq趋势一致。 (2)高亚硝酸盐胁迫日本囊对虾转录组分析：在浓度为80mg/L的高亚硝酸盐胁迫下，分别于6、12、24、48和96h取日本囊对虾的肝胰腺以及对照组的肝胰腺进行转录组测序。10个文库共获得920785608个CleanReads，数据量为6.48G-7.34G，Q30大于93.07%。利用Trinity软件组装后获得46308条unigenes，N50为1833bp。与对照组相比，分别得到593、606、1089、497和988个DEGs。我们对DEGs进行注释，得到与免疫和代谢相关通路和基因。并通过qPCR对随机选择的9个差异基因(DPD、ABCH、ProPOb、ACADL、CYP2J、PAT4、BHMT、CLEC和PEPCK)进行验证，其表达量与RNA-seq趋势一致。 (3)日本囊对虾TPS基因的克隆和表达：MjTPS基因cDNA全长3308bp，编码844个氨基酸，其分子质量为95.82ku，pI为6.45，具有Glyco_transf_20domain和Trehalose_PPasedomain两个保守的功能结构域。系统进化树显示MjTPS基因与甲壳类动物聚为一支。qPCR结果显示，MjTPS在肝胰腺中表达水平最高，在低盐胁迫6-96h内MjTPS基因的表达量显著上调再下调，而在高亚硝酸盐胁迫6-96h内MjTPS基因表达水平呈现上调-下调-上调的趋势。 (4)MjTPS基因干扰后功能研究：MjTPS基因干扰后的3-48h自身表达量显著下降，海藻糖的含量也显著下降。低盐和高亚硝酸盐氮胁迫MjTPS基因沉默后的日本囊对虾，结果显示，与对照组相比，死亡率显著增加；MjTPS基因自身的表达水平以及下游产物合成量都显著降低；免疫基因PMO25、ERP、CD、HSP90、HSP70、HSP60、HMC和CLEC2的表达量发生了显著的改变，通过促进或抑制来参与日本囊对虾的免疫应答。其中，CD和ERP属于溶酶体通路，推测当MjTPS基因被沉默后，日本囊对虾通过抑制溶酶体通路来参与免疫应答。另外，我们发现MjTPS基因沉默会影响CHI1、ERP和CHS这3个与蜕皮相关的基因的表达量，推测TPS基因可能与蜕皮相关。
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