摘要
脂肪组织是生命的物质基础，可以储存能量、维持体温恒定、缓冲外界压力、促进脂溶性维生素的吸收、为人体提供必需脂肪酸，同时脂肪含量也是评价牛肉品质的重要因素之一，适当的脂肪含量既可以提高牛肉的营养价值又能保证良好的口感。脂肪的发育受一系列复杂过程的调节，包括环状RNA(circRNA)在内的非编码RNA(ncRNA)在调节脂肪细胞的增殖和分化中起着重要作用。circRNA可作为miRNA分子海绵发挥其生物学效应，本研究采用高通量测序技术，分析了秦川牛不同发育时期脂肪组织中circRNA的表达，对犊牛及成年牛脂肪组织中的差异表达的circRNA进行了鉴定，筛选出与脂肪发育相关的circFUT10。过表达及干扰circFUT10后，利用CCK-8、EdU、流式细胞周期技术、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Westernblot技术以及油红O染色技术对circFUT10的功能进行了鉴定。同时利用双荧光素酶报告系统、sensor实验以及RIP技术验证了circFUT10可作为竞争性内源RNA与PPARGC1B基因竞争性结合miRNAlet-7c，促进脂肪细胞增殖抑制其分化。揭示了circFUT10调控秦川牛脂肪增殖与分化的机理，为秦川牛的育种工作提供新的理论依据。主要研究结果如下： 1.秦川牛脂肪组织circRNA的鉴定及筛选 秦川牛皮下脂肪组织高通量测序在犊牛和成年牛中共检测到14274个circRNAs,其中有8809和9937个circRNAs分别在犊牛和成年时期表达，有4427个circRNAs在两个时期都能检测到。大多数circRNAs由1~4个外显子组成，一个宿主基因可以产生1~5个circRNAs，少数基因会产生10个以上circRNAs。有307个circRNAs在两个时期差异表达，其中151个circRNAs在犊牛时期显著下调，156个circRNAs在成年牛时期显著下调。GO分析发现共有339个功能组，KEGG分析共富集到27条通路。RT-qPCR验证发现circFUT10高表达且差异表达，作为候选circRNA进行下一步研究。 2.circFUT10促进牛脂肪细胞增殖抑制牛脂肪细胞分化 Sanger测序验证了circFUT10的真实性，扩增了circFUT10全长，成功构建了过表达载体pCD2.1-circFUT10。利用CCK-8、EdU、流式细胞周期技术、RT-qPCR、Westernblot以及油红O染色实验发现，circFUT10能显著促进脂肪细胞的增值活力以及增殖标志基因PCNA和CDK2的表达，抑制脂肪分化标志基因PPARγ和C/EBPβ的表达同时减少脂滴的数量，从而揭示了circFUT10促进脂肪细胞的增殖，抑制脂肪细胞分化的结果。 3.circFUT10通过吸附let-7c来促进脂肪细胞增殖，抑制其分化 RNAhybrid软件预测发现circFUT10含有let-7家族的结合位点。双荧光素酶报告系统发现let-7c和let-7e显著抑制pCK-circFUT0的荧光活性，let-7c的抑制作用更显著，let-7csensor实验发现circFUT10可以挽救由于过表达let-7c引起的荧光活性的降低，RIP实验发现circFUT10和let-7c都可以与AGO2蛋白结合，进一步说明circFUT10可以吸附let-7c。RT-qPCR、Westernblot以及油红O染色实验发现，let-7c可抑制脂肪增殖标志基因PCNA和CDK2的表达，促进脂肪分化标志基因PPARγ和C/EBPβ的表达，共表达circFUT10后可以缓解这种作用，表明circFUT10是通过吸附let-7c来促进脂肪细胞增殖并抑制其分化。 4.circFUT10可与PPARGC1B基因竞争性结合let-7c促进脂肪细胞增殖抑制其分化 双荧光素酶报告系统发现PPARGC1B是let-7c的一个靶基因，过表达circFUT10可缓解let-7c对PPARGC1B基因的抑制作用。合成PPARGC1B的干扰片段si-PPARGC1B转染牛脂肪原代细胞，CCK-8、EdU、流式细胞周期技术、RT-qPCR、Westernblot以及油红O染色实验发现，si-PPARGC1B降低了脂肪细胞的增殖活力以及增殖标志基因PCNA和CDK2的表达，促进分化标志基因PPARγ和C/EBPβ的表达以及脂滴的形成。由此可见circFUT10能够通过结合let-7c释放其靶基因PPARGC1B，从而促进PPARGC1B的表达，进而调控秦川牛脂肪细胞的增殖和分化。 本研究对不同发育时期秦川牛皮下脂肪组织进行转录组测序并筛选出与脂肪发育相关的circFUT10，构建circRNA-miRNA-mRNA网络揭示了circFUT10调控秦川牛脂肪细胞增殖分化的机理，为牛脂肪组织发育的分子机制提供了新的思路，也为秦川牛分子育种工作提供了一定的借鉴。
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