摘要
骨质疏松症是最常见的代谢性骨病，对老龄化社会造成了巨大的公共健康负担。维生素D通过促进钙和磷的肠道吸收对机体骨骼的形成和矿化发挥间接调节作用。因此，维生素D缺乏长期以来被认为是骨质疏松的重要危险因素。然而，近年来一些研究表明，预防性的补充维生素D不仅无法达到预防骨质疏松的目的，甚至会降低骨密度并增加骨折的风险。作为维生素D的活性成分，1,25(OH)2D3对骨稳态的直接作用存在争议且机制尚未阐明。因此，围绕以上问题，本研究以探索维生素D对骨组织的作用为出发点，Wnt和TGF-β信号通路在1,25(OH)2D3调控骨稳态中的作用为核心，构建不同维生素D水平的模型小鼠为载体，设计了一系列体内和体外实验，以探究单纯维生素D缺乏是否会导致骨质疏松和1,25(OH)2D3对骨稳态的调控作用及机制。 在这项研究中，首先我们构建了维生素D缺乏小鼠及对这种缺乏进行挽救的模型小鼠。MicroCT成像分析和HE染色的组织学切片结果显示维生素D水平降低的小鼠与对照组小鼠之间的骨质和骨量没有统计学差异，提示在不引起钙磷水平改变的情况下，维生素D缺乏不会导致骨质疏松症。此外，通过钙黄绿素荧光标记和TRAP染色结果，意外发现体内维生素D含量的降低加速了骨骼的骨形成率和矿化沉积率，并减缓骨组织的吸收。该结果为解释临床上所发现的高剂量补充维生素D反而使骨密度降低提供了线索。 为了探索1,25(OH)2D3对骨稳态的直接调控作用，我们通过体外实验对经1,25(OH)2D3干预的MC3T3-E1、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages, BMMs)的生物学行为进行评价。通过碱性磷酸酶和茜素红染色实验发现1,25(OH)2D3处理后的MC3T3-E1和BMSCs的早、晚期成骨向分化均受到明显抑制。同时采用AlamarBlue、免疫荧光染色、TRAP染色、WesternBlot等实验发现1,25(OH)2D3对BMMs的破骨向分化起着正调控的作用。我们还建立了成骨、破骨细胞共培养体系，进一步确认1,25(OH)2D3在骨稳态中抑制成骨细胞的分化及活性，激活破骨细胞发生。 接着，我们提取出模型小鼠的BMSCs和BMMs，通过一系列体外试验发现1,25(OH)2D3对于各组模型动物来源的细胞均发挥着抑制成骨、促进破骨的作用。并且这种作用不会随着体内维生素D水平的改变而发生变化。 最后，为了深入探究1,25(OH)2D3对骨稳态调控的机制，我们采用高通量技术进行转录组层面测序。将表达量差异基因进行富集分析后发现，经1,25(OH)2D3处理后上调的基因多为在破骨向分化中发挥正调控作用的基因，而下调的基因富集于Wnt和TGF-β等与成骨向分化紧密相关的信号通路。基于以上证据及一系列分子生物学手段验证，我们认为1,25(OH)2D3可能通过激活BMSCs的VDR使Wnt信号通路(LRP5-β-catenin-RUNX2)和TGF-β信号通路(BMP2-RUNX2-SP7)下调，从而抑制了成骨细胞的分化和成熟。同时，BMSCs中激活的VDR刺激了RANKL的表达和分泌。高表达的RANKL与破骨细胞前体上的RANK结合，促进破骨细胞的分化，增强骨吸收活性。
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