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MafB调控桔小实蝇对阿维菌素敏感性的分子机制研究

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桔小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)是世界性果蔬害虫，广泛分布于热带与亚热带地区。化学防治是目前防治桔小实蝇的主要方法。但由于杀虫剂的大量使用，桔小实蝇对不同药剂均产生了抗药性且日趋严重，其中桔小实蝇对阿维菌素的敏感性也逐年下降，其抗性发展和治理形势严峻。目前的研究表明，谷胱甘肽S转移酶、细胞色素P450、羧酸酯酶等多种代谢酶在转录水平的过表达导致解毒代谢能力增强，是桔小实蝇抗药性迅速发展的重要机制。有研究表明转录因子能够调控代谢酶的转录而参与调节昆虫对多类杀虫剂的敏感性。 据此，本论文通过桔小实蝇转录组和基因组数据鉴定了转录因子BdMafB，克隆获得其cDNA全长序列。使用实时定量PCR(RT-qPCR)技术，分析了桔小实蝇BdMafB基因的时空表达模式及多种解毒酶基因的不同组织表达模式。通过阿维菌素药剂处理解析了BdMafB及多种解毒代谢酶的响应表达模式。利用RNAi技术及生物测定探究了BdMafB调控多种解毒代谢酶基因的表达，进而影响桔小实蝇对阿维菌素的敏感性。具体研究内容及结果如下： 1桔小实蝇BdMafB的分子克隆及时空表达模式分析 1.1BdMafB分子克隆及序列分析 通过比对分析桔小实蝇转录组与基因组数据库，我们克隆获得了BdMafB的cDNA全长。序列分析结果表明，其开放阅读框(open reading frame，ORF)序列有1323bp，编码440个氨基酸。系统发育分析结果表明BdMafB与地中海实蝇、橄榄实蝇亲缘关系最近。氨基酸序列结构与功能的分析结果显示BdMafB具有转录因子bZIP家族特有的两个保守功能域，即碱性结构域(Basic regine)和亮氨酸拉链(Leucine zipper)结构，其中包含19个形成二聚体界面的位点及13个DNA结合的位点，暗示其能形成二聚体结合到代谢酶基因的启动子，进而调控解毒酶基因的表达。 1.2BdMafB的时空表达模式 采用RT-qPCR方法解析桔小实蝇BdMafB在不同发育阶段表达模式，结果表明BdMafB从卵期到成虫期均有表达，随着成虫日龄的不断增加该基因的表达量不断升高且成虫第7天的表达量最高。解析BdMafB在成虫期不同组织的表达模式，结果表明BdMafB在马氏管及中肠中表达量低而在脂肪体中表达量高且差异显著。由于脂肪体中含有大量的解毒代谢酶，能解毒代谢外源有毒物质(如杀虫剂)以及转化能源物质(脂类，蛋白类)，储存能量及传送能量进而满足生物体的能量需求。因此推测BdMafB可能参与调控桔小实蝇解毒代谢酶基因的表达。 2阿维菌素诱导表达及基于RNAi的BdMafB功能分析 2.1阿维菌素处理后BdMafB响应模式 采用点滴法，用阿维菌素(LC40=11ng/头)处理4日龄成虫，收集处理12h后的桔小实蝇并提取RNA，通过RT-qPCR检测BdMafB基因的表达量。结果表明与丙酮处理的对照相比，BdMafB表达量在阿维菌素处理12h后出现显著上调，而在处理24、36h后，其表达量并无显著差异。 2.2BdMafB基因沉默后桔小实蝇对阿维菌素的敏感性 利用RNAi技术沉默BdMafB的表达，随后我们采用鉴别剂量阿维菌素(LC40=11ng/头)进行生物测定，进一步明确BdMafB对桔小实蝇阿维菌素敏感性的影响。结果表明，注射dsBdMafB的24h后，BdMafB的沉默效率最高为88.4%。RNA干扰24h后的试虫生物测定结果显示，BdMafB基因被有效沉默后，桔小实蝇死亡率为50.4%，注射dsGFP的对照组死亡率为36.9%，且两者存在显著性差异，这说明BdMafB参与了桔小实蝇对阿维菌素的敏感性调控。 3BdMafB下游解毒代谢酶基因的发掘 3.1候选解毒代谢酶不同组织及阿维菌素诱导后的表达模式 基于本课题组的前期研究结果，共筛选获得30个候选代谢酶基因作为BdMafB可能调控的下游靶标基因。采用RT-qPCR方法解析了30个候选代谢酶基因在桔小实蝇脂肪体、马氏管及中肠的表达模式，结果表明GSTd6在马氏管转录水平最低，在脂肪体和中肠中表达量高。BdGSTz2、BdGSTe6、BdCYP437A3、BdCYP4AC4和BdaE6表达模式与BdMafB高度一致，均呈现在马氏管及中肠中表达量低而在脂肪体高且差异显著，基于此我们推测上述5个解毒代谢酶的表达可能受BdMafB调控。在LC40阿维菌素处理36h后，与丙酮处理的对照相比，上述5个解毒代谢酶中的BdGSTz2和BdCYP437A3表达量显著上调，而BdGSTe6、BdCYP4AC4及BdaE6表达量均无无显著差异。结果表明BdGSTz2及BdCYP437A3的表达可能受到BdMafB调控。 3.2BdGSTz2、BdCYP437A3基因沉默后桔小实蝇对阿维菌素敏感性变化 为进一步验证BdMafB与BdGSTz2和BdCYP437A3的调控关系，利用RNAi技术沉默BdMafB的表达，通过RT-qPCR检测BdGSTz2与BdCYP437A3的转录水平，结果表明抑制BdMafB的表达后，BdGSTz2与BdCYP437A3的表达量显著下调。RNAi结果表明在注射dsRNA24h后，BdGSTz2及BdCYP437A3的沉默效率最高分别为94.1%，75.5%。阿维菌素生物测定结果显示，干扰了BdGSTz2后的试虫敏感性显著上升，而干扰BdCYP437A3组试虫敏感性与对照并无显著差异。结果表明，BdMafB通过调节BdGSTz2的表达参与调控桔小实蝇对阿维菌素的敏感性。

唐光慧

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桔小实蝇 转录因子 MafB基因 解毒代谢 阿维菌素

硕士

农业昆虫与害虫防治

蒋红波

2020

西南大学

中文

S4