摘要
研究背景：骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是常见的恶性骨肿瘤，在骨肿瘤中发病率最高，且好发于儿童及青少年，危害性最大。骨肉瘤一旦发展为远端转移，5年生存率仅为20%-30%。目前临床常规治疗中还是以大量的使用化疗药物为主，大量化疗药物导致的严重不良反应,令不少临床医生望而生畏，但小剂量的化疗又达不到治疗效果。因此，尽管骨肉瘤的治疗已经取得很大的进展，但找到更好的骨肉瘤治疗替代方案还一直是研究人员关注的重点。 肿瘤的细菌疗法作为一种新型，相对副作用小且高度靶向肿瘤的疗法在近年逐渐受到业界关注。鼠伤寒沙门氏菌可以在人和动物肠道内寄生，并且能在宿主细胞内生长和繁殖，属于革兰氏阴性兼性厌氧菌，是迄今为止肿瘤治疗领域中研究最广泛的细菌之一。其中VNP20009是一种通过基因工程改造获得的减毒沙门氏菌，purI基因缺失使其繁殖必须依赖外源性腺嘌呤，而msbB基因缺失降低了细菌本身产生的内毒素，具有出色的安全性和抗生素敏感性。同时VNP20009还降低了自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，能够避免产生严重的炎症反应。VNP20009在包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌以及乳腺癌等小鼠实体瘤模型显示了较好的疗效。美国进行的Ⅰ期临床试验也成功证明了其安全性，但并没有表现出良好的治疗效果。因此，基于VNP20009的基因工程改造以期获得更好的治疗效果一直是该研究领域的热点。 研究发现，区别于正常细胞，大多数肿瘤细胞具有甲硫氨酸依赖性。基于这种特性，研究者通过在肿瘤患者饮食中限制甲硫氨酸摄入或者给予甲硫氨酸酶(L-methioninase)特异性消耗体内甲硫氨酸来治疗肿瘤。但是长期的饮食限制甲硫氨酸会使机体营养不良。而由于哺乳动物不表达甲硫氨酸酶，外源性给予甲硫氨酸酶往往引起机体的免疫反应。因此，更为安全有效的治疗方案也是科学家和临床专家们一直在积极探索的难关。我们通过基因工程的方法，在沙门氏菌VNP20009中转入甲硫氨酸酶基因获得了新的菌株VNP20009-M，VNP20009-M具有良好靶向肿瘤特性的同时又能够特异消耗肿瘤中的甲硫氨酸，本研究将深入探究VNP20009-M对骨肉瘤的治疗作用。 研究目的： 探讨基因工程菌VNP20009-M对骨肉瘤的治疗作用及其机制。 研究方法： 1.通过电转法将质粒PSV-SPORT，PSV-SPORT-L-methioninas转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，构建基因工程菌VNP20009-V(携带空载质粒的对照菌株)与VNP20009-M(携带甲硫氨酸酶基因的目的菌株)； 2.将重组沙门氏菌VNP20009-M与骨肉瘤细胞MNNG-HOS共培养，研究其对骨肉瘤细胞凋亡的影响； 3.将携带甲硫氨酸酶基因的质粒瞬时转染进骨肉瘤细胞MNNG-HOS、U2OS及SaoS-2中，获得高表达甲硫氨酸酶基因的骨肉瘤细胞，研究其对骨肉瘤细胞增殖、迁移及凋亡的影响； 4.利用MNNG-HOS细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型，通过瘤内注射不同剂量的VNP20009-M，评价其在动物模型中的治疗效果。 5.利用MNNG-HOS细胞系构建裸鼠全身转移模型，通过尾静脉注射VNP20009-M治疗，评价其在转移模型中的治疗效果。 研究结果: 1.菌落PCR与质粒PCR验证结果显示甲硫氨酸酶基因成功转入VNP20009中，且VNP20009-M甲硫氨酸酶活性是对照菌株的10倍，表明重组沙门菌VNP20009-M构建成功； 2.VNP20009-M与骨肉瘤细胞MNNG-HOS共培养，显著诱导肿瘤细胞的凋亡； 3.相比对照组，骨肉瘤细胞高表达甲硫氨酸酶后其增殖、迁移的能力被显著抑制； 4.VNP20009-M治疗显著抑制裸鼠皮下肿瘤生长，且不影响荷瘤小鼠生存状态。 5.VNP20009-M治疗显著抑制骨肉瘤骨转移的发生并提高小鼠生存率。 结论： VNP20009-M在体外能够抑制细胞增殖、迁移，诱导细胞凋亡；在体内减缓肿瘤生长速度，阻断骨转移发生且能够提高荷瘤小鼠生存率。是一种新型高效且副作用小的骨肉瘤治疗药物，具有潜在的临床应用价值。
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