摘要
马立克病（MD）是由马立克病病毒（MDV）感染机体引发的传染性恶性淋巴细胞肿瘤病。MDV以气源介质间接或直接在鸡群间传播，感染机体后可引发免疫抑制，降低宿主对其它病原体的抵抗力。MD具有极高的发病率及死亡率，对世界养禽业造成了巨大的经济损失。长期以来，我国养鸡场采用弱毒疫苗免疫接种鸡群，使该病得到了有效控制。但近年来，由于集约化的养殖模式以及疫苗持续免疫压力作用下，MDV进化出更强的毒力，突破了现有的疫苗保护，使得MD疫情时有爆发。利用更先进的基因编辑技术开展M D V基因与功能、致病/致瘤机制及诊断技术研究，将对MD的防控将起到重要作用。 作为MDV致病/致瘤相关基因，pp38被认为在早期溶细胞感染中起到重要作用。以其为研究对象构建基因缺失毒株，将对揭示pp38基因的功能和抗体的筛选等提供有利的技术支撑。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以MDV超强毒株GX0101为研究模型，对p p38基因进行编辑和缺失。根据已报道的GX0101基因组p p38基因序列设计了6条靶向pp38基因的向导RNA（gRNA），分别克隆至pX459载体中，构建了pX459-gRNA表达质粒。通过pX459-gRNA配对组合，转染并通过PCR分析初步评价gRNA基因编辑切割效率，选出高效率的gRNA。使用高效率gRNA组合编辑GX0101的pp38基因，利用PCR检测筛选并成功亚克隆传代培养出稳定的p p38基因缺失毒株GX0101△p p38。测序结果分析证明，获得的MDV基因缺失株pp38基因已按预期进行精准剪切。对缺失毒株和亲本毒株进行生物学特性鉴定：qRT–PCR检测缺失毒株GX0101△pp38与亲本毒株GX0101的MEQ、pp38、gB、RLORF6、UL6、UL13、UL42、UL52基因的转录水平，结果显示pp38基因的缺失不影响除pp38以外其它参考基因的表达；间接免疫荧光（IFA）结果显示，pp38蛋白在缺失毒株感染的CEF细胞中无表达。 基于GX0101△p p38缺失毒株不表达p p38蛋白的特性，我们进一步利用GX0101亲本毒株和p p38基因编辑缺失毒株交叉筛选的策略，用间接免疫荧光实验（IFA）对本实验室此前已建立的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库进行了筛选，从7株MDV单抗杂交瘤细胞株中鉴定获得2株抗MDV pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株4F9和27H3。相关研究结果初步证实了pp38基因编辑缺失毒株可用于病毒蛋白单克隆抗体的筛选和鉴定，具有很好的应用前景，已鉴定的相关单克隆抗体也为后续pp38的相关研究提供了重要的实验材料。 综上，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了vvMDV毒株GX0101的pp38基因缺失毒株，将其应用于筛选和鉴定单克隆抗体并初步筛选获得2株抗MDV-1pp38蛋白的单克隆抗体，为后续MDV诊断试剂研发及基因功能研究奠定了重要的基础。
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