摘要
目的：骨关节炎（OA）是最常见的退行性疾病之一，在老年人群中发病率高，导致关节长期疼痛和关节畸形恶化，显著降低患者生活质量，并对社会医疗卫生资源造成严重负担。目前研究认为控制局部慢性炎症是延缓OA发展的关键指标。蒙花苷是一种广泛存在于菊科中的天然黄酮苷类化合物，在多种疾病中具有抗炎作用。本研究旨在探讨蒙花苷对OA软骨的保护作用。 方法：（1）：体外细胞实验：分离、培养人软骨原代细胞，取2~5代人软骨细胞与脂多糖（LPS）和蒙花苷共培养。为评估蒙花苷的抗炎作用，实验分组为对照组，单纯LPS处理组，LPS+蒙花苷（7.5，15，30μM）组，而探索蒙花苷作用机制时，实验分组为对照组，单纯LPS处理组，LPS+蒙花苷组（30μM），单纯蒙花苷组（30μM）.Western blot检测软骨细胞iNOS和COX-2蛋白水平，ELISA、GRIESS反应法检测IL-6、TNF-α、PGE2和NO水平验证蒙花苷对脂多糖（LPS）诱导的人软骨细胞炎症反应的影响。ELISA法检测软骨细胞中Ⅱ型胶原、aggrecan、MMP13和ADAMTS-5的含量，免疫荧光检测Ⅱ型胶原和ADAMTS-5水平，验证蒙花苷对脂多糖（LPS）诱导的人软骨细胞外基质变性的影响。western blot检测IκBα和核中p65蛋白的表达水平，免疫荧光染色检测p65核移位情况验证蒙花苷对脂多糖（LPS）诱导的人软骨细胞NF-κB途径的影响。竞争ELISA法检测生物素标记LPS与rhMD-2和rhTLR4的结合情况，免疫共沉淀法检测TLR4-MD-2在软骨细胞中的形成复合物的情况，Western Blot检测MyD88、IRAK-1和TRAF-6的蛋白表达水平，验证蒙花苷对脂多糖诱导的TLR4/MD-2信号激活的影响。（2）体内动物实验：将45只10周龄C57BL/6雄性野生型（WT）小鼠，随机分为3组，每组15只，分别为假手术组（SHAM），造模组（DMM），DMM+蒙花苷治疗组。造模8周后行X光检查评估膝关节关节间隙、骨赘形成和软骨表面钙化变化，切片用番红O-固绿（S-O）染色后观察记录，然后用国际骨关节炎研究学会（OARSI）评分验证蒙花苷在动物体内对骨关节炎的保护作用。 结果：（1）蒙花苷抑制LPS诱导的人OA软骨细胞的炎症反应，Western blot结果显示蒙花苷呈剂量依赖性抑制LPS诱导的iNOS和COX-2的表达，ELISA法及GRIESS反应法结果显示蒙花苷呈浓度依赖性抑制LPS诱导的内源性NO、PGE2、IL-6和TNF-α的表达。（2）蒙花苷保护了由LPS诱导的细胞外基质降解，ELISA及免疫荧光结果显示蒙花苷治疗组提高了Ⅱ型胶原和aggrecan的表达，抑制了MMP13和ADAMTS-5的表达，（3）蒙花苷抑制了LPS诱导的人骨关节软骨细胞NF-κB激活，Western blot，免疫荧光结果显示，蒙花苷抑制了由LPS诱导的IκBα的降解及p65入核（4）蒙花苷抑制了LPS/TLR4/MD-2复合物的形成，竞争ELISA检测及免疫共沉淀显示，蒙花苷降低LPS与rhMD-2的连接，但不降低rhTLR4的连接（5）蒙花苷抑制了由LPS激活的TOLL样受体活化，Western Blotting检测结果显示蒙花苷抑制了LPS刺激导致的MyD88、IRAK-1和TRAF-6的表达（6）动物实验中，X线显示蒙花苷治疗组关节间隙变窄及软骨表面钙化的情况较造模组较轻，番红O-固绿（S-O）染色显示蒙花苷改善了膝关节失稳导致的软骨表面糜烂，细胞计数降低，蛋白质丢失，并较DMM组相比有更低的OARSI评分。 结论：蒙花苷通过抑制人软骨细胞TLR4/MD-2和NF-κB信号传导抑制LPS诱导的炎症反应，并且有保护软骨的作用，联合小鼠体内造模，表明蒙花苷可能是治疗OA的有效药物。
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