摘要
目的：在圆红冬孢酵母中重构薏苡仁油生物合成途径中Δ12-脂肪酸去饱和酶（Δ12-FADS），提高圆红冬孢酵母油脂中亚油酸含量。 方法：首先检测薏苡不同生长时期不同组织器官中的脂肪酸含量，选取油酸、亚油酸含量差距较大的样品进行转录组测序，结合薏苡基因组信息筛选Δ12-FADS基因序列并进行密码子优化及合成。以圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）基因组DNA为模板，扩增内源性强启动子pPGK和终止子tHSP后插入载体pCAMBIA-2300的多克隆位点区，再将合成的功能基因构建在启动子和终止子之间，获得重组质粒。重组质粒电转化农杆菌GV3101，借助农杆菌介导转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法对酵母进行转化，经过抗性筛选、表型验证、基因型验证后获得工程菌株。对重组菌株进行磷限制条件发酵，发酵后检测重组菌株中油脂的组成及含量。 结果：（1）油酸和亚油酸在薏苡种仁和种皮中含量丰富，生长早期和末期的含量差距明显，故选用早期和末期的种子进行转录组测序；（2）成功改造植物表达载体pCAMBIA-2300，除应用于本研究外也为改造R.toruloides提供了一个新的表达元件；（3）成功获得酵母工程菌，经检测其中亚油酸含量有大幅提高，相对亚油酸含量增加了5倍。 结论：本研究以薏苡仁为研究对象，利用基因工程和代谢工程策略筛选薏苡仁中关键的Δ12-FADS，并在产油酵母中异源表达，构建生产薏苡仁甘油三酯的细胞工厂。该研究将为中药材主要活性成分生物合成与相应的非模式菌株代谢途径调控提供全新的思路，同时为平衡薏苡仁甘油三酯质量与产量研究提供全新的平台，节约土地资源，有益于中药材资源的可持续利用。
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