摘要
固有免疫反应是宿主抵御外来病原微生物的第一道防线。天然免疫系统通过模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）识别外源病原体，激活信号转导通路，诱导干扰素（interferons,IFN）、炎症因子等的分泌，进而使宿主细胞产生防御能力。干扰素激活蛋白（stimulator of interferon genes,STING）是固有免疫反应中一个重要分子，主要通过cGAS-STING通路发挥免疫防御和抗肿瘤作用。环鸟苷酸腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase,cGAS）识别胞质内的各种DNA分子，并将其转换成环二核苷酸（cyclic dinucleotides,CDNs）。然后，CDNs与STING相互作用并使STING蛋白发生构象改变，进而激活下游的TANK结合激酶1（TANK binding kinase1,TBK1）、转录因子干扰素调节因子3（interferon regulatory factor，IRF3）和核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）,从而诱导产生Ⅰ型IFN和炎症因子。随着STING晶体结构的报道，为人们通过基于结构的药物设计，发现新型STING激动剂提供了一定的基础。因此，STING是一个非常有意义的药物靶点，可以通过设计STING的激动剂激活STING通路，进而发挥抗肿瘤、抗病毒以及抗菌的作用。 本文主要研究工作包括三部分： 1.基于STING晶体复合物设计、合成新型的STING激动剂 由于STING通路被激活后可产生强效的免疫反应，STING激动剂的研究也受到了科学界的广泛关注，但目前尚处于起步阶段。一般来讲，STING激动剂是指天然配体CDNs类化合物，该类化合物具有天然配体的结构、相对明确的机制和本身强力的诱导作用。但是，CDNs较差的理化性质为其临床研究带来了挑战，具体如下：1）它们不遵循Lipinski规则，较差的膜渗透性将直接影响它们的临床试验结果；2）它们易受磷酸二酯酶的降解；3）由于分子量较大，所以它们的改造空间有限。因此，越来越多的科研工作者致力于开发新型的小分子STING激动剂，统称为非CDNs类STING激动剂。小分子STING激动剂5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸（5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid,DMXAA）可以减少上述CDNs类化合物的不利因素，但是DMXAA只能激活鼠源STING通路。研究结果表明，STING蛋白的氨基酸序列进行微小地突变，可以提高DMXAA对人源STING蛋白的敏感性。其中，162位和266位的突变氨基酸位于配体与STING蛋白直接结合的结合口袋区域，对DMXAA类化合物的设计与改造具有十分重要的意义。 2.在细胞水平筛选和确定吖啶酮类衍生物为广谱STING激动剂 为了满足对已合成化合物活性评价的要求，本文选择了三个细胞系：293T-Dual?hSTING-R232Cells、293T-Dual?mSTINGCells和THP1-Dual?KO-STING Cells（所有细胞系来源于Invivogen公司，可以间接测量被化学标记的免疫分子来验证STING各通路的活性）。293T-Dual?hSTING-R232Cells和293T-Dual?mSTING Cells均来源于293T细胞，前者用来测试化合物对人源STING通路的激动活性，后者用来考察样品对鼠源STING通路的激活水平。本文用敲除STING蛋白的THP1-Dual?KO-STING Cells，进一步确认化合物是否依赖STING蛋白介导信号的转导。本文使用上述细胞系进行活性筛选，考察化合物激活STING通路的水平、种属特异性以及对STING蛋白的依赖性。 本文筛选化合物体外活性的工作分为两个部分，初步活性筛选和效力确定筛选。通过两步的筛选，本文发现了6个活性分子化合物，分别为化合物2、3、11、28、33和34。其中，化合物2、3和33只能在鼠源STING细胞中诱导产生免疫因子。具有吖啶酮骨架结构的化合物11、28和34，都表现出了跨物种的STING激动活性，并且它们通路的激活依赖于STING。令人惊喜的是，筛选活性最好的化合物34的活性水平与天然配体2’3’-cGAMP相当，化合物34在人源和鼠源STING细胞中的EC50值分别为7.45μM和10.23μM。这些体外的活性结果成功地验证了，基于STING晶体复合物设计新型STING激动剂的设计思路是正确的。为了探索吖啶酮类衍生物突破种属特异性的原因，本文还全面分析了各类化合物的构效关系（Structure-Activity Relationships,SARs），并得到很多非常有价值的信息，可为提高新型STING激动剂的活性提供帮助。最值得注意的是，本文发现去除化合物34中的任何一个取代基，都会使其活性骤减。因此，我们下一步的研究可以化合物34作为先导化合物，主要对N、C-4和C-7位进行修饰，从而增强该类化合物对STING通路的激动活性。 3.吖啶酮类STING激动剂的机制研究 本文通过蛋白结合实验和细胞因子诱导实验，对吖啶酮类STING激动剂激活STING通路的机制进行了研究。根据STING激动剂是否直接与STING蛋白结合来发挥免疫效应，人们可以将STING激动剂划分为直接和间接两类。CDNs和DMXAA均为直接STING激动剂，它们激动活性强、结合机制明确并且可作为工具分子研究STING通路的新机制。然而，间接STING激动剂的激动活性一般较差，其可能激活STING通路的上游或者下游的蛋白来诱导产生免疫因子，甚至有可能通过激活其他通路来间接激活STING通路。因此，在蛋白水平验证活性化合物是否直接结合STING蛋白，对于STING激动剂的活性评价至关重要。本文首先选用了Cisbio研发的人源STING结合力检测试剂盒，对吖啶酮类STING激动剂进行了测试，实验结果成功地证明了它们为直接STING激动剂。其中，化合物34依然表现出了最强的结合亲和力。等温滴定量热法（IsothermalTitration Calorimetry,ITC）是目前小分子化合物与蛋白结合最为认可的测试方法，本文又对化合物34进行了ITC的补充实验，其实验结果与竞争结合力实验的筛选结果相一致。同时，本文还对吖啶酮类分子与STING结合的作用机制进行了初步地探讨。 根据分泌细胞因子的不同，STING通路被分为STING-IRF3通路和STING-NF-κB通路。受到STING激动剂的刺激后，STING-IRF3通路主要负责分泌Ⅰ型IFNs，而STING-NF-κB通路则产生炎症因子，如TNFα。因此，通过检测STING激动剂激活通路而诱导产生各种细胞因子的水平，使我们不仅可以了解化合物激活通路的强度，还能初步地探索其诱导机制。本文利用实时荧光定量核酸扩增法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR），对化合物34激活天然免疫细胞THP-1，从而诱导产生细胞因子的基因表达水平进行了测试，检测免疫因子包括IFNβ、TNFα、IL-6和IP-10。同时，本文在实验中为STING激动剂设定了浓度、时间两个梯度，多元化的实验结果可以更好地量化吖啶酮类STING激动剂的免疫学效应，如激动活性、激活时效和持续效应的时间等等。实验结果显示，化合物34在激活STING通路诱导细胞因子的能力要强于阳性分子2’3’-cGAMP，特别是其分泌炎症因子TNFα。本文推测，化合物34和2’3’-cGAMP诱导细胞因子的作用机制是不同的，化合物34可以有效地激活STING-IRF3和STING-NF-κB两个通路，且其对NF-κB途径的激活效应明显比2’3’-cGAMP更强。 本文的创新点为：1）本文基于STING蛋白晶体复合物，以获得广谱STING激动剂为目的，合理设计了四类化合物并成功地合成30余个全新结构的小分子化合物。2）通过不同细胞系对所合成目标化合物进行体外活性评价后，本文鉴定了吖啶酮类化合物为新型小分子STING激动剂；这些吖啶酮类STING激动剂成功地突破了种属特异性，在人源和鼠源STING细胞中都展现了出色的激动活性。3）本文对实验数据进行整理归纳后，分析总结出化合物的基本构效关系；对于吖啶酮类STING激动剂来说，C-2位的甲氧基是活性关键基团，5,6位的双甲基取代是其获得人源性的关键。4）本文还对吖啶酮类化合物激活STING通路的作用机制进行了研究，实验结果证明吖啶酮类STING激动剂是与STING直接结合而激活通路的，同时还可以激活STING-IRF3和STING-NF-κB双通路。本文选用2’3’-cGAMP为阳性对照物，原因如下：1）它是天然的STING激动剂，也是CDNs类化合物的代表；2）它是目前STING激动剂和通路研究的金标准，与它进行比较最具有说服力。值得注意的是，大多数非CDNs类STING激动剂的激动效应与2’3’-cGAMP相差甚远，但是通过多方面的评价后，本文发现吖啶酮类化合物的激动活性比2’3’-cGAMP稍强。综上所述，吖啶酮类STING激动剂具有激动效应强、分子量小、改造空间大以及作用机制明确等优点，其不仅为STING通路新机制的发现奠定了基础，也为抗肿瘤、抗菌以及抗病毒的免疫治疗提供了新的思路。
NETL