摘要
目的：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一。自噬作为一种重要的非选择性降解机制，可以通过维持细胞稳态和细胞代谢以及细胞活力影响肿瘤的发生和发展。CircCDRlas作为促癌基因在癌症中的作用已经被证实，但是circCDRlas在OSCC中对自噬的调控机制尚未明确。本研究旨在探讨circCDRlas与OSCC细胞自噬的潜在性机制。 方法：1、采用免疫组化检测57对OSCC组织和癌旁组织中低氧诱导因子和自噬相关蛋白的表达，并分析它们的相关性；采用低氧处理Tca-8113细胞后，应用Westernblot、免疫荧光和透射电镜的方法检测低氧条件对细胞自噬和细胞凋亡的影响。2、构建circCDRlas环状过表达真核载体，在OSCC细胞系Tca-8113中过表达circCDRlas;经低氧干预、雷帕霉素或3-MA处理后，应用RT-PCR、Western blot和免疫荧光实验检测细胞自噬变化和circCDRlas表达变化，评价circCDRlas对低氧介导的自噬的调控作用。3、在低氧条件下，采用CCK-8和细胞流式仪通过3-MA进一步验证circCDRlas介导的自噬和内质网应激(ER stress)反应对OSCC细胞增殖活性和凋亡的影响。4、应用Western blot和活性氧(ROS)检测探讨低氧微环境下circCDRlas对下游信号通路及自噬流顺利进行的调控。5、基于生物信息学，确定circCDRlas与miR-671-5p碱基互补配对种子区，双荧光素酶报告基因实验检测circCDRlas与miR-671-5p之间是否存在靶向关系，同时分析circCDRlas是否能够通过吸附miR-671-5p参与细胞自噬。6、合成circCDRlas的过表达慢病毒，构建裸鼠移植瘤动物模型，进一步验证circCDRlas对自噬及肿瘤生长的调控作用。 结果：l、与癌旁组织相比，低氧诱导因子lα和自噬相关蛋白在OSCC组织中表达均升高；并且处于低氧条件下的OSCC细胞，自噬效应明显增加，而细胞凋亡减少。2、Western blot和免疫荧光结果提示circCDRlas可促进低氧介导的细胞自噬；有趣的是，低氧微环境可升高circCDRlas的表达水平。3、CCK-8实验和细胞流式仪检测发现circCDRlas能显著促进OSCC细胞活力及显著抑制OSCC细胞凋亡，而经3-MA处理后细胞活力明显下降；低氧处理细胞16小时后，细胞活力达到峰值；Westernblot和CCK-8实验结果表明低氧条件进一步促进了过表达circCDRlas细胞的增殖能力和内质网应激。4、CircCDRlas促进了OSCC细胞溶酶体膜蛋白LAMP2和TFEB的表达水平，提示自噬溶酶体的形成，低氧的处理进一步加速了这一过程；Westernblot结果显示是circCDRlas促进了磷酸化AKT和ERKk的表达，激活AKT和ERK1/2通路而去磷酸化mTOR的水平。这表明circCDRlas可以通过激活OSCC细胞中的AKT/ERK。／mTOR通路来调节自噬。同时，我们还发现低氧条件下circCDRlas调控的ROS水平可能促进OSCC细胞自噬的发生。5、根据TargetScan，Circlnteractome和RegRNA2.0三个数据库的维恩图，提示circCDRlas与hsa-miR-671-5p，hsa-miR-7和hsa-miR-1270存在良好的碱基互补关系，采用双荧光素酶报告验证了circCDRlas与hsa-miR-671-5p的靶向关系；在OSCC细胞中过表达miR-671-5p后，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值减小，然而与circCDRlas共转染后，可解除对自噬效应的抑制。6、体内实验结果表明：与对照组相比，circCDRlas过表达可显著增加肿瘤的体积和重量，低氧诱导因子和自噬相关蛋白表达均发生显著升高。 结论：低氧微环境下circCDRlas介导的细胞自噬促进了OSCC细胞增殖活性以适应肿瘤微环境。因此，circCDRlas联合自噬抑制剂为口腔鳞状细胞癌的治疗提供了新策略。
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