摘要
哺乳动物生殖启动的关键因子Kisspeptin是Kiss-1基因编码的一种短肽。在对多种哺乳动物的研究中发现，Kisspeptin在下丘脑、神经中枢、卵巢等部位均有分布，而它的最小活性片段，具有高度物种间保守性的Kisspeptin-10（Kp-10）对动物卵巢内的颗粒细胞的增殖和孕酮的分泌具有促进作用。Kp-10是否对青海牦牛卵巢颗粒细胞的增殖和激素分泌同样具有调控作用，目前还不清楚。 本试验采用抽吸法提取青海牦牛卵巢颗粒细胞，并使用免疫荧光技术检验培养的细胞是否为卵巢颗粒细胞；HE染色观察细胞形态；CCK及ELISA检测Kp-10对细胞增殖和孕酮分泌影响；流式细胞仪检测Kp-10对颗粒细胞凋亡的影响。在进一步的研究中，结合ELISA方法和流式细胞仪技术，初步探讨Kp-10对青海牦牛卵巢颗粒细胞分泌孕酮可能的作用机制。本研究主要包含以下三个部分： （1）体外培养青海牦牛卵巢颗粒细胞。选取适宜卵巢，抽吸法提取细胞，免疫荧光（FSHR）检验其是否为颗粒细胞。HE染色和CCK法，探究颗粒细胞在体外培养过程中的细胞形态和细胞活性变化。试验结果表明，FSHR阳性率>97%，验证了其为卵巢颗粒细胞；细胞生长良好，呈多角形或梭形，并伸出伪足，呈放射状生长。24h后，进入对数生长期，于72h后，进入平台期。 （2）Kp-10对体外培养的青海牦牛卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和孕酮分泌的影响。细胞在含有FBS的培养基中培养贴壁后，逐步替换至无血清培养。加入不同浓度的Kp-10，CCK法观察细胞在72h内的增殖情况，ELISA法检测孕酮含量，流式测凋亡。结果表明，Kp-10处理可显著增加颗粒细胞的活力（p<0.05），100nmol·L-1时可显著促进孕酮的分泌（p<0.05），PI染色，细胞有凋亡。 （3）Kp-10对青海牦牛卵巢颗粒细胞孕酮分泌的作用机制可能受胞内钙离子信号通路影响。加入不同浓度的Kp-10、Verapamil单独或共同处理细胞24h后，ELISA测孕酮含量，流式测胞内钙离子荧光强度。结果表明，Verapamil降低孕酮分泌，20、50nmol·L-1时，达显著降低水平（p<0.05）；100nmol·L-1Kp-10与不同浓度的Verapamil共同处理时，孕酮含量有所提升，但不能逆转其对孕酮分泌的抑制作用（p>0.05）；流式细胞仪测得胞内Ca2+浓度，其结果与检测的颗粒细胞孕酮分泌水平相一致。 综上，Kp-10能促进体外培养的青海牦牛卵巢颗粒细胞增殖，其影响孕酮分泌的机制可能与胞内Ca2+浓度相关。
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