摘要
目的： 本研究通过将丙戊酸钠作用于体外培养的多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226以及U266细胞株，结合多种自噬流检测方法，观察两细胞系自噬流的情况，从而全面准确地反映自噬过程，探讨自噬过程参与多发性骨髓瘤疾病发生及进展的分子生物学机制，为丙戊酸钠用于临床治疗提供理论依据。 方法： 体外培养人源性多发性骨髓瘤RPMI8226以及U266细胞株，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。将实验细胞分为4组并分别给予不同处理：空白对照组、丙戊酸钠组（8mmol/L）、氯喹组（8μg/ml）以及两药联合组。以细胞计数试剂盒8（CCK8）分别检测药物处理6h、12h、24h、48h的细胞增殖抑制情况；经查，观察细胞自噬情况时细胞的增殖抑制率不可太低也不可太高，20%-30%为宜，因此根据增殖抑制率选定本实验的药物处理时间为24小时，完成后续实验。采用实时定量PCR法检测自噬标志性蛋白LC3B的mRNA相对表达水平；蛋白质免疫印迹法（Western Blot）用于验证LC3B的翻转实验，即不同药物处理组间LC3B蛋白的表达情况；应用Cyto-ID自噬检测试剂盒进行荧光染色，用流式细胞仪检测各组自噬阳性细胞的平均荧光强度；应用双标腺病毒完成病毒转染实验，利用荧光显微镜观察单体红色荧光蛋白（m RFP）—绿色荧光蛋白（GFP）—微管相关蛋白轻链3（LC3）自噬双标腺病毒转染RPMI8226以及U266细胞后自噬小体的形成和自噬流的变化情况。 结果： 1不同实验处理组对人源性多发性骨髓瘤RPMI8226和U266细胞株的增殖抑制情况通过CCK-8法检测：检测不同药物处理上述MM细胞系不同时间（6、12、24h、48h）后的增殖抑制率，发现药物增殖抑制率随作用时间的延长而增高(P＜0.05)。药物作用时长为24h，自噬现象观察更优。 2自噬标志性分子LC3-Ⅱ的mRNA以及蛋白表达在不同药物分组处理24小时的结果：RT-qPCR提示：8mmol/L VPA组、8μg/ml CQ组以及两药联合组作用于MM细胞系24小时后，RPMI8226和U266细胞LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表达量，两药联合组与空白对照组以及单药组比较，均明显提高，且组间差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）。 3以Cyto-ID自噬检测试剂盒进行荧光染色，使用流式细胞仪检测各组自噬阳性细胞的平均荧光强度。两药联合组自噬阳性细胞的平均荧光强度明显高于其他组别。 4单体红色荧光蛋白（m RFP）-绿色荧光蛋白（GFP）-微管相关蛋白轻链3（LC3）自噬双标腺病毒转染实验提示：VPA实验组的总斑点数较空白对照组增加，且红色斑点明显增多，黄色斑点数量较对照组增多。 结论： 1丙戊酸钠通过诱导自噬流产生，引起自噬小体增多，激活自噬过程。 2丙戊酸钠对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266具有增殖抑制作用，诱导多发性骨髓瘤细胞株自噬表达增强可能是丙戊酸钠发挥抗肿瘤的分子基础之一。
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