摘要
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下简称金葡菌）是全世界医院和社区获得性感染的主要病原体，对医疗保健系统构成了巨大负担。葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal enterotoxin B，SEB）是金葡菌感染致病的主要因子之一。作为超抗原，SEB与主要组织相容性复合体的Ⅱ类分子（MHCⅡ）和T细胞受体（TCR）的特定Vβ区域结合，扰乱免疫系统，激活单核/巨噬细胞和T淋巴细胞并诱导高水平的促炎细胞因子、趋化因子、组织因子、裂解酶和活性氧，激活炎症和凝血途径，从而导致内皮细胞损伤、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征和中毒性休克综合征。此外，SEB常与伴有呕吐、腹痛、腹泻等症状的食物中毒有关。作为具有气溶胶稳定性的致死性和致残剂，SEB是一种明确的细菌毒素类生物战剂。 至今还没有批准用于治疗SEB诱发疾病的疫苗或特效药物。目前的研究涉及多种治疗方向，比如针对SEB的疫苗或治疗性抗体、细胞受体与毒素相互作用的抑制剂、信号转导和细胞因子诱导抑制剂。能尽快中和毒素、发挥治疗作用的高亲和力抗体是抗生素和疫苗的重要支撑和补充，可能是治疗紧急干预相关感染的最佳方法和无法接种疫苗的免疫缺陷患者的最佳选择。 前期采用单个B细胞技术筛选得到的SEB人源性单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）M0313代表着一种预防和治疗SEB疾病的潜在免疫疗法。本研究通过检测抗体mAb M0313体外对SEB中和作用，体内对SEB诱发中毒性休克、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）诱发脓毒血症的保护作用，鉴定中和SEB活性的B细胞表位，评价mAb M0313作为针对SEB诱发疾病治疗用抗体制剂的可能性。 研究目的： 评价mAb M0313的体外结合及中和活性、体内针对SEB及MRSA菌株的免疫保护效果，鉴定其识别SEB的免疫优势表位，为研发针对SEB诱发疾病和金葡菌感染的治疗用抗体制剂奠定实验基础。 研究方法： 1.mAb M0313的表达及鉴定。将构建的mAb M0313重链和轻链重组质粒瞬时转染HEK293F细胞，表达并纯化mAb M0313，采用ELISA、WB和BLI评价mAb M0313与野生型金葡菌肠毒素B（Wild type Staphylococcal enterotoxin B，wSEB，以下称SEB）、突变型金葡菌肠毒素B（Mutant Staphylococcal enterotoxin B，mSEB）的亲和力。 2.mAb M0313的体外中和效果评价。在小鼠脾淋巴细胞和人外周血单核细胞（PBMC）中，检测mAb M0313抑制SEB刺激细胞增殖和细胞因子释放的中和活性，采用流式细胞术，检测mAb M0313对SEB与MHCⅡ、TCR结合的阻断作用。 3.mAb M0313的体内免疫保护效果评价。SEB加D-半乳糖胺对小鼠攻毒，静脉注射mAb M0313治疗，观察小鼠生存率、血清炎症因子水平和脾肺病理变化，评价抗体对SEB诱发中毒性休克的免疫保护作用；采用国际标准株MRSA252和MRSA临床分离株JN028、JN064攻毒小鼠，静脉注射mAb M0313治疗，观察小鼠生存率，评价抗体对MRSA诱发脓毒血症的免疫保护作用；小鼠腹腔注射金葡菌Xen29（携带荧光素酶报告基因），静脉注射mAb M0313治疗，在攻毒后第1、3、5天活体成像观察细菌发光情况，评价抗体对金葡菌体内增殖的抑制作用。 4.mAb M0313与SEB结合的表位定位。设计合成包含SEB全长的重叠多肽、免疫优势肽的截短肽和突变肽，采用ELISA鉴定mAb M0313与多肽的结合活性，鉴定SEB与抗体结合的B细胞表位和关键氨基酸。 研究结果: 1.编码抗体质粒转染HEK293F细胞成功表达了mAb M0313，经亲和层析纯化后，纯度约为97.8%。mAb M0313与SEB和mSEB有良好结合作用并经过免疫印迹证明。BLI证实mAb M0313能以nM级的亲和力与SEB、mSEB结合。 2.mAb M0313对SEB诱发小鼠脾淋巴细胞和人BPMC增殖和产生的细胞因子均具有剂量依赖的抑制作用。流式细胞术结果显示，mAb M0313能SEB与MHCⅡ结合，也能抑制SEB与TCR结合。 3.在SEB诱发致死性休克小鼠模型中，mAb M0313的保护率为100%，降低了小鼠血清中的炎症因子浓度，减轻了小鼠脾脏和肺脏病理损伤情况。在MRSA诱发脓毒症中，mAb M0313对MRSA252预防性给药的保护率为100%，治疗性给药的保护率为37.5%，mAb M0313预防性给药对产SEA、C、D和E的JN028的保护率为33.3%，对产SEB的JN064的保护率为77.8%。金葡菌Xen29腹腔感染小鼠的模型中，在攻毒后第1、3、5天，活体成像显示抗体组的小鼠荧光强度都显著低于阳性对照组（P＜0.05）。 4.ELISA鉴定包含SEB全长的20条重叠多肽中，SEB85-102的吸光度最高。进一步鉴定SEB85-102与3条其截短多肽及6条其突变多肽，SEB85-102和SEB88-102与mAb M0313的结合为阳性；SEB85-102突变Y90或Y91或Y92后与mAb M0313的结合由阳性变为阴性阴性。 研究结论： 1.可获得高纯度的抗SEBmAb M0313，mAb M0313与SEB和mSEB亲和力良好，平衡解离常数可达到nM级。 2.mAb M0313可在小鼠脾淋巴细胞和人PBMC中抑制SEB刺激的细胞增殖和细胞因子释放作用，并且可干扰SEB与MHCⅡ、TCR的结合作用，表明mAb M0313对SEB有良好的体外中和效果。 3.mAb M0313的免疫治疗可降低体内炎症因子水平、减轻脏器病理损伤、提高生存率，从而保护感染小鼠抵抗SEB诱发的中毒性休克；同时mAb M0313也能保护MRSA攻毒小鼠所诱发的脓毒血症，减少金葡菌的体内增殖，预防性给药保护效果优于治疗性给药，对非产SEB的MRSA感染也有交叉保护作用，表明mAb M0313对SEB诱发的中毒性休克及MRSA诱发的脓毒血症具有一定的免疫保护作用。 4.SEB与mAb M0313结合的B细胞表位是SEB85-102，其序列高度保守，关键氨基酸为Y90、Y91和Y92，SEB85-102与SEB90-92位于SEB三维结构的N端折叠结构域中连接五链β-桶状结构的螺旋部分。
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