摘要
酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是质子门控的阳离子通道，在外周和中枢神经系统中广泛表达。1a型酸敏感离子通道（ASIC1a）是酸敏感离子通道家族的重要亚单位成员，与体内许多生理和病理过程都有密切的关系，比如突触传递与发育，学习与记忆、恐惧抑郁相关行为等生理过程和疼痛、炎症、癫痫、多发性硬化等多种涉及组织酸中毒的病理过程。基于ASIC1a的生理、病理作用，ASIC1a的抑制剂在开发有效的镇痛药物、神经保护药物或药物设计前导分子中有着非常重要的应用，因此如何获得或改造具有高选择性和高活性的ASIC1a的抑制剂一直是神经生物学研究中的一个热点。 本研究在ASIC1a的选择性抑制剂PcTx1的框架下构建一个随机多肽文库。同时以ASIC1a为靶标，利用酵母双杂交的方法从这个随机文库中筛选出对ASIC1a有调节或抑制作用的活性多肽，从而达到建立一个高效的、便捷的获得ASIC1a抑制剂的筛选体系的目的。针对上述目的，本研究主要完成了以下三个部分的工作。 第一、通过PCR的方法在PcTx1的框架下构建完成了一个库容量为3.05×106的随机五肽文库。随机挑选了30个单克隆进行随机文库的丰度测试，测序结果表明随机文库中90%的序列符合实验设计的初衷，且30个单克隆中没有重复序列，证明了所构建的随机文库具有较好的丰度。 第二、在以PcTx1为框架的随机五肽文库中，以rASIC1a的胞外区域为“诱饵”，利用酵母双杂交系统来筛选与rASIC1a胞外区域可能有互相作用的多肽分子。通过一轮的酵母双杂交的筛选过程，在酵母缺陷型培养基——四缺培养基的平板上一共获得了44个阳性克隆结果。分析这44个阳性结果的氨基酸序列，其中5个质粒（L9;L23;L24;L25;L37）符合我们实验的最初设计，只是在五个关键氨基酸残基的位点上突变产生了与PcTx1不同的氨基酸残基，基本保持了PcTx1具有的ICK模型，剩余的39个质粒都在随机化过程中发生了移码，对应产生了57-61个氨基酸残基组成的多肽，这些多肽中大多都含有一段大小为27个氨基酸残基的保守序列。 第三、利用MP cloning无缝克隆的方法将筛选得到的5个质粒（L9;L23;L24;L25;L37）分别插入到表达载体pET43-His-SUMO中，构建相应的表达质粒。在大肠杆菌ShuffleTM中通过自动诱导表达的方法诱导表达融合蛋白，利用镍柱对融合蛋白进行亲和层析纯化，纯化后的融合蛋白使用SUMO激酶-Ulp1切割掉SUMO标签并释放出相应的多肽分子。多肽分子被释放后利用反相液相色谱对多肽分子进行进一步纯化，获得了的可以用于生理活性检测的高纯度的多肽分子。通过MALDI-TOF质谱鉴定，异源表达的L9;L23;L24;L25;L37的鉴定分子量（其鉴定分子量分别为4520.7896Da、4383.4268Da、2965.5471Da、4518.2383Da和4520.6313Da）与其理论分子量（其理论分子量分别为4520.19Da、4383.31Da、2965.91Da、4518.18Da和4520.19Da）一致。此外还对部分多肽分子进行了生理活性的检测，确定了多肽分子L37在1μM的浓度下能够抑制20%rASIC1a的通道电流。 综上所述本研究建立一个高效的、便捷的获得ASIC1a抑制剂的筛选体系，并且提供了一个适用于含有多对二硫键的多肽分子的表达系统，在较大程度上简化了获得或改造高选择性和高活性的ASIC1a的抑制剂的过程和步骤，为开展ASIC1a的靶标配体方面的研究以及开发与之相关的药物或药物前导分子提供了一定的理论支持和物质基础。
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