摘要
多环芳烃(PAHs)是污染土壤中常见的持久性有机污染物(POPs)，具有致畸、致癌、致突变三种效应(三致)。土壤PAHs通过植物吸收积累，再由生物链传递而危害人体健康和生态安全。因此寻求有效方法来去除污染区植物体内PAHs，降低植物有机污染风险、保障农产品安全、实现污染土壤的资源化至关重要。目前，利用具有PAHs降解功能的植物内生细菌来;台理PAHs污染已成为研究热点。然而，关于从受PAHs污染的健康植物体内筛选出具有PAHs降解功能的内生细菌，并重新定殖到目标植物体内，以降低土壤和植物体内PAHs污染水平的研究仍很薄弱。 本文从长期受PAHs污染的健康植物麦冬(Ophiopogon japonicus)体内分离筛选出1株具有较高芘降解能力的内生细菌PRd5，系统探究了环境条件对其生长和芘降解能力的影响，初步探讨了其芘降解机制，以及其定殖于上海青体内对上海青吸牧和降解芘的影响。该研究结果为利用功能植物内生细菌降低土壤和植物体内PAHs污染风险、保障农产品安全、合理利用污染土壤提供了理论基础和菌种支持。主要研究成果如下: 1.植物内生细菌Enterobacter sp.PRd5的分离筛选及芘降解特性 本文通过平板直接分离法，从受PAHs污染的麦冬体内分离筛选出l株具有较高芘降解能力的内生细菌PRd5，通过其培养特征、生理生化性质与16S rRNA基因序列同源性分析，初步鉴定菌株PRd5为肠杆菌属(Enterobacter sp.)。研究菌株PRd5的生长特性发现，其最佳的生长条件为:pH值7.0，温度30℃，外加盐浓度5g·L-1，装液量10mL/100mL。30℃、150r·min-1摇床培养条件下，菌株PRd5对芘(50mg·L-1)10d的降解率为41.37％-50.63％，对萘(500mg·L-1)、芴(100mg·L-1)、菲(50mg·L-1)等低分子量多环芳烃(LMW-PAHs)7d的降解率均高于95％，对荧蒽(50mg·L-1)和苯并[a]芘(10mg·L-1)等高分子量多环芳烃(HMW-PAHs)10d的降解率分别为35.89％和17.44％。通过对菌株PRd5降解芘的优化条件研究发现:pH值6.0-8.0，温度25-35℃，外加盐浓度0-10g·L-1，装液量10-30mL/100mL，接种量3-17％，初始芘浓度25-50mg·L-1，以及外加100mg·L-1的葡萄糖时，可获得较高的芘降解率。 2.植物内生细菌Enterobacter sp.PRd5的芘降解机制 本文以肠杆菌PRd5为对象，根据中间产物、降解基因、降解酶推测其芘降解途径。利用HPLC-MS定性分析了菌株PRd5降解芘的中间产物，得到了4,5-环氧化芘、4，5-二羟基芘、2-羟基-2-氢-苯并吡喃-2-羧酸、1-羟基-2-蔡甲酸、水杨酸、顺式-2’-苯亚甲基丙酮酸和龙胆酸或原儿茶酸7种物质。采用Illumina Miseq结合第三代测序技术完成菌株PRd5的全基因组测序，发现其降解基因中同时存在编码邻苯二酚双加氧酶和原儿茶酸双加氧酶的基因，并且菌株PRd5的基因组含有60个重要的脱毒基因，在PAHs降解过程中扮演重要作用，其编码的蛋白包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶、醌还原酶、醌氧化还原酶等。菌株PRd5的粗酶液中检测到1-羟基-2-萘甲酸羟化酶、1-萘酚羟化酶、水杨酸羟化酶、邻苯二甲酸双加氧酶、邻苯二酚-1，2-双加氧酶、龙胆酸-1，2-双加氧酶等芘降解酶的活性。最后推测菌株PRd5降解芘的环羟基化首先发生在C-4和C-5位置，并且降解过程中存在两条平行的下游途径:水杨酸途径和邻苯二甲酸途径。 3.植物内生细菌Enterobacter sp.PRd5在上海青体内的定殖特性 本文对功能菌株PRd5采用抗生素抗性标记技术进行标记，其中菌株PRd5对氨苄青霉素(50mg·L-1)和红霉素(50mg·L-1)有抗性。将这两种抗性作为菌株PRd5的筛选标记，结合浸种、灌根、涂叶三种定殖方式将菌株PRd5定殖到目标植物上海青(Brassica chinensis)体内。结果表明，功能菌株PRd5可以良好地定殖于上海青组织中，并能够提高上海青的生物量，且较高密度的菌株PRd5定殖在上海青组织中能够有效地降低上海青体内芘浓度和芘积累量。例如，接种21d后，上海青根部和茎叶部菌株PRd5的定殖数量分别为4.79-5.84Ig CFU·g-1FW和4.36-5.58Ig CFU.g-1FW；接种菌株PRd5的上海青和不接种的相比，鲜重和干重提高了53.93％-80.11％和40.93％-105.55％，根部和茎叶部的芘去除率提高了51.14％-67.89％和49.84％-65.21％。同时，接种菌株PRd5能够提高土壤中芘的去除率。
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