摘要
研究目的： 1.探讨OK-432及肿瘤抗原致敏的树突状细胞（DC）疫苗原位注射以及联合免疫检查点阻滞剂PD-1抗体对实验动物脑胶质瘤的治疗作用，并对可能的机制进行探索。 2.根据已有的研究基础，开展DC疫苗联合免疫检查点阻滞剂PD-1抗体临床试验，并对试验进展及初步结果进行介绍。 研究方法： 1.建立小鼠胶质瘤模型，通过头磁共振(MRI)检查，观察成瘤及肿瘤变化情况，纪录小鼠的生存时间；取小鼠骨髓细胞，体外培养小鼠DC；应用肿瘤裂解物及OK-432致敏DC细胞，并评估DC功能。将成瘤的小鼠分为6组，分别为PBS皮下对照组（组1），DC疫苗皮下治疗组（组2），PBS颅内对照组（组3），DC疫苗原位治疗组（组4），PD-1单药治疗组（组5），DC疫苗原位治疗联合PD-1抗体组（组6）。观察六组小鼠肿瘤生长速度，小鼠生存时间。最后进行机制研究，通过脑组织标本行免疫组织化学染色，评估肿瘤局部淋巴细胞浸润的情况。应用AimPlex技术测定DC培养液及各组小鼠外周血细胞因子含量，评估DC疫苗的功能及对小鼠整体免疫状态的影响。 2.根据目前已有的基础实验结果开展了DC疫苗联合PD-1抗体治疗胶质母细胞瘤的临床试验，筛选符合入组标准的胶质母细胞瘤患者纳入治疗组，初步拟纳入20人。其中DC疫苗来源于外周血单核细胞诱导而成。对治疗组患者定期行磁共振检测，外周血细胞因子检测，并统计生存时间。 研究结果： 1.C57BL/6小鼠颅内造模，可以百分之百的脑内成瘤获取原位胶质瘤小鼠模型,模型小鼠第3天可以在MRI上看到成型的脑胶质瘤，其生存时间为造模后3-4周，重复性好。 2.小鼠骨髓细胞经体外诱导，可以成功诱导分化为DC细胞，幼稚DC细胞表现为CD11chigh，CD80low、CD8low、MHC-Ⅱlow；随后应用肿瘤细胞裂解物及OK-432共同致敏DC，使其成熟并获得提呈肿瘤特异性抗原的能力，此时表型为CD11c high，CD80high、CD86high、MHC-Ⅱhigh，符合成熟DC细胞的表现；与常用佐剂LPS对比，OK-432对DC细胞的刺激作用二者之间无差别。此时的DC细胞可以作为疫苗应用于肿瘤的治疗。经此方法获取的DC疫苗重复性好，DC细胞占比高，可获得稳定的成熟DC疫苗。 3.首先对比DC疫苗皮下治疗（组2）肿瘤负荷较大胶质瘤模型小鼠（即造模3天后开始治疗），并与组1进行对比，分别比较肿瘤生长速度和生存期，经对比，两组之间模型小鼠生存期无明显差异，颅内肿瘤生长速度也无明显差异。为探索有效的控制负荷较大肿瘤生长的方法，通过枕大池注射，将疫苗原位应用于颅内（组4），并与原位PBS对照组进行对比，结果显示41.2%的胶质瘤小鼠肿瘤生长减慢，在术后7天时二者肿瘤体积无明显差异，但14天及21天时，原位DC疫苗治疗组肿瘤体积明显小于对照组。为了进一步增强DC疫苗的效果，将原位DC疫苗及PD-1抗体联合治疗载瘤小鼠，结果显示，单独PD-1（组5）治疗对小鼠肿瘤无抑制作用，其肿瘤生长速度及小鼠生存时间与PBS对照组无明显差异，而二者联合治疗效果明显提高，其肿瘤生长速度虽与单独原位DC疫苗治疗组无差别，但其总体对肿瘤的抑制效果明显提高，61.5%颅内肿瘤生长速度减慢。与原位DC疫苗单药治疗相比明显提高。 4.为探索原位治疗的机制，对各组小鼠脑组织进行免疫组化染色，染色抗体包括CD3，CD4，CD8，CD11b，PD-1，经计数后发现在原位DC疫苗治疗组及联合治疗组中，CD4+T淋巴细胞及CD11b+髓系细胞明显多于其他组，二者在颅内治疗中发挥了重要作用。随后分析CD11b+髓系细胞的具体分类，对连续切片染色，CD11b+细胞表现为CD11b+anti-Ly6g-CD11c-，最终考虑这部分细胞性质为胶质瘤相关髓系细胞（glioma associated myeloid cells;GAMs）；经免疫组化染色发现PD-1抗体表达阴性，因此联合PD-1抗体在抑制肿瘤进展中的作用机制仍需要进一步研究。对DC培养液进行细胞因子检测，可见成熟DC可产生大量细胞因子及趋化因子，改善肿瘤周围免疫微环境；原位DC疫苗对小鼠整体免疫的影响通过检测血清中细胞因子含量进行评估，结果发现与对照组相比，DC疫苗原位治疗组小鼠血清中IFN-γ,IL-6,IL-10含量明显增多，原位应用DC疫苗对于荷瘤小鼠的整体免疫也产生了影响。随后将治疗组中治疗有效的小鼠与无效小鼠分组研究，结果可见，在治疗有效组中IFN-γ含量明显高于治疗无效组，而治疗无效组中IL-6,IL-10含量则明显高于治疗有效组。由此可见DC疫苗在不同个体中诱导不同免疫反应，其中血清中IFN-γ分泌增多可以协同DC疫苗，达到控制肿瘤生长的目的。 5.临床试验中，按入组标准目前入组2例患者，1例复发患者生存时间为6个月，1例初发患者在术后1月快速复发后生存时间为12个月，且在疫苗治疗期间肿瘤复发进展得到一定控制。但由于目前入组人数较少，效果需进一步观察。 研究结论： 小鼠GL261脑胶质瘤原位模型侵袭性强，能够有效的模拟人脑胶质母细胞瘤，小鼠骨髓细胞诱导分化DC疫苗成熟稳定，经肿瘤抗原及OK-432刺激可获取具有递呈肿瘤特异性抗原的DC疫苗。皮下注射DC疫苗对于肿瘤负荷较大个体治疗效果差，而原位应用DC疫苗效果好，可控制部分荷瘤小鼠肿瘤的生长；而且通过联合PD-1抗体可提高疗效；通过机制显示CD4+T淋巴细胞及CD11b+髓系细胞在这一过程中发挥了重要作用，同时IFN-γ在这一过程中发挥了重要作用。但在肿瘤局部各种细胞的相互作用，及具体作用机制仍需要更深入探索。根据前期基础，开展了相关临床试验，目前已纳入2例患者，目前试验仍在开展中，但已初步看到治疗效果。
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