摘要
目的： 通过免疫共沉淀联合质谱筛选果蝇Tap蛋白的互作因子，探索tap基因在果蝇神经发育中的调节机制。 方法： （1）免疫荧光和Western blot方法检测tap转基因果蝇品系中HA标签的表达 利用免疫荧光染色观察HA标签在tap转基因果蝇体内表达模式是否正确；通过Western blot检测Tap-HA蛋白其大小是否正确，并据此判断HA标签是否正常工作。 （2）免疫共沉淀及Western blot检测Tap-HA标签靶蛋白的表达 使用IP级别的HA抗体识别并拉取果蝇胚胎全蛋白中与Tap-HA互作的蛋白，然后用HA标签抗体再次检测Co-IP后的标签靶蛋白。 （3）质谱鉴定并筛选与Tap-HA蛋白相互作用的因子 利用质谱仪LC-MS/MS鉴定通过Co-IP获得的与Tap-HA相互作用的蛋白液成分，再通过数据库分析，文献检索与标签靶蛋白Tap-HA相互作用的蛋白，并按照细胞定位，生物过程和分子功能等注释分类，进一步筛选可能与Tap互作的蛋白。 结果： （1）利用免疫荧光染色HA标签，发现在果蝇胚胎13期腹部神经索有Tap-HA标签绿色荧光信号；通过Western blot检测，大约在45KDa处可见一个清晰的目的蛋白条带。 （2）免疫共沉淀后的电泳银染结果提示IP实验组蛋白显著富集，有多条蛋白分离条带，肉眼可观45KDa处有一条清晰条带，IgG对照组可见数条分离蛋白条带，Input组蛋白条带最多，在45KDa处可看到清晰条带。此结果表明Co-IP成功的富集到与靶蛋白互作的蛋白。 （3）质谱仪LC-MS/MS的鉴定结果：实验IP组鉴定到535个蛋白，IgG组鉴定到458个蛋白。其中，两组样品同时鉴定到相同蛋白255个，IgG样品组、IP样品组分别鉴定到的差异特有蛋白质数分别是203、280个；通过生信分析，筛选出与靶蛋白互作的候选因子Nerfin-1，Da，Beag，Nab2，Pnuts，Taf6，If。 结论： 本实验通过免疫共沉淀，成功的富集到与Tap-HA标签靶蛋白互相作用的蛋白；免疫共沉淀联合质谱鉴定出280个与靶蛋白直接或间接相互作用的蛋白，通过对候选蛋白功能注释及生物信息软件分析，筛选出Nerfin-1，Da，Beag，Nab2，Pnuts，Taf6，If与Tap相互作用，在tap转录调控过程中发挥主要作用，为tap基因功能机制研究打下坚实的基础。
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