摘要
研究目的： 胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)等代谢性疾病的重要病理生理学基础，有氧运动因为能改善机体能量代而被广泛应用于临床肥胖和T2DM的干预、治疗。然而，目前关于有氧运动改善机体能量代谢稳态及IR的确切机制仍不完全清楚。组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase, HDAC)在调控细胞内多种基因的转录平衡中起重要作用。前期研究结果表明，II型HDAC中的HDAC4/5能显著影响糖脂代谢过程从而调控机体骨骼肌能量代谢，且有氧运动能显著降低胰岛素抵抗小鼠模型中的HDAC4/5表达。Scriptaid作为一种HDAC抑制剂，研究发现它具有模拟运动改善糖、脂代谢表型的效应，这可能与其抑制HDAC及调节细胞内蛋白的乙酰化修饰有关，但Scriptaid具体能影响哪些蛋白的乙酰化则不甚清楚。 与磷酸化、甲基化修饰等相比，对乙酰化的研究一直停滞不前。随着高通量组学技术的发展，开展大规模乙酰化修饰研究现今已无技术障碍。最近10年的研究结果表明，乙酰化修饰在机体代谢调控中有重要作用，它能调控大量代谢酶的活性。越来越多的证据表明，乙酰化普遍修饰代谢酶，并能调节代谢酶的活性从而调控机体代能量谢通路。 综上所述，本课题探讨HDAC抑制剂—Scriptaid在有氧运动改善骨骼肌能量代谢中影响糖、脂代谢关键酶乙酰化修饰的作用，以期揭示乙酰化修饰改善机体能量代谢的机制，从而为预防、治疗IR和T2DM等代谢性疾病提供新的靶点。 研究方法： (1)动物模型：5周龄C57BL/6雄性小鼠27只，适应性喂养一周后随机分为安静对照组(NC)、运动组(NE)及Scriptaid给药组(S)。运动干预及给药干预结束后，进行有氧能力测试、肌力测试及体成分分析，随后处死取材。 (2)运动方案：运动组小鼠干预6周，运动形式为75%VO2max强度的有氧跑台运动，坡度为0，60分/次，1次/天，5次/周。 (3)给药方案：Scriptaid给药组小鼠干预6周，腹腔内注射Scriptaid药剂(溶解于含5%DMSO中的生理盐水)，剂量1mg/kg体重，1次/天，5次/周。 (4)有氧运动能力测试：随机从安静对照组、Scriptaid给药组中选取3只小鼠放在坡度为0的跑台上进行12m/min的持续运动，记录小鼠力竭至脱水状态再也不能运动的时间。 (5)肌力测试：将小鼠放置于YLS-13A大小鼠肌力测试仪的测试平台上，待小鼠四肢抓住测试平台上的固定杆后，向后拉小鼠尾巴从而带动测试平台后移，记录肌力读数，重复4次。 (6)体成分检测：运动干预结束后使用“ImpediVet实验动物组成测定分析仪”测定小鼠的体脂含量、去脂体重、体质指数等指标，随后统计分析。 (7)OGTT测试：待测小鼠在前日晚7点断食，自由饮水，次日晨8点取尾静脉血测空腹血糖；用20%葡萄糖生理盐水灌胃，剂量1ml/kg体重，分别记录灌胃后15分钟、30分钟、60分钟、120分钟时间点的血糖值，统计分析。 (8)蛋白乙酰化修饰组学测定：蛋白抽提、胰酶酶解、TMT标记、HPLC分馏、亲和富集、LC-MS/MS分析、数据库检索。 (9)计算机分子对接模拟:使用AutoDockv4.2.6软件对目标蛋白及其底物小分子进行分子对接模拟，记录并分析对接结果。 研究结果： (1)6周有氧运动及Scriptaid给药均能增强小鼠有氧运动耐力、骨骼肌肌力及柠檬酸合酶活性；6周有氧运动能显著降低小鼠的体重、体脂含量、体质指数并增加小鼠的摄食效率，但Scriptaid对小鼠体重、体脂含量、体质指数无影响。 (2)6周有氧运动显著降低小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、胰岛素和游离脂肪酸含量，且OGTT曲线在15、30、60min时间点上显著低于安静对照组，OGTT曲线下面积显著降低，运动显著改善小鼠葡萄糖耐量；Scriptaid给药不影响血清胆固醇、甘油三酯，却显著降低血清胰岛素和游离脂肪酸含量，且OGTT曲线在15、30、60min时间点上显著低于安静对照组，OGTT曲线下面积显著降低，Scriptaid给药显著改善小鼠葡萄糖耐量。 (3)运动及Scriptaid给药均引起小鼠骨骼肌中大量蛋白质乙酰化修饰差异变化；运动显著改变中糖代谢关键酶Pfkm、Pkm、Pgk1、Pdha1、Idh1和Ogdh的乙酰化修饰，同时显著改变脂代谢关键酶Acadm、Hadha、Hadh及Acaa2的乙酰化修饰；Scriptaid给药显著改变糖代谢关键酶Pfkm、Pkm、Pgk1、Pdha1、Idh1和Ogdh的乙酰化修饰，同时显著改变脂代谢关键酶Acadm、Hadha、Hadh和Acaa2的乙酰化修饰。 (4)计算机分子对接模拟实验结果：Pfkm，144K乙酰化改变了其与底物fructose6-phosphate的结合；Pgk1，139K乙酰化改变了其与底物1,3-diphosphoglycerate的结合，275K不影响其和底物1,3-diphosphoglycerate的结合；Pdha1,147K乙酰化影响其与底物pyruvate的结合；Pkm，206K乙酰化后其与底物ADP结合改变，与底物phosphoenolpyruvate结合没变化；Idh1，81K乙酰化后与底物NADP+的结合改变；Ogdh，564K乙酰化后其与底物2-oxoglutarate的结合发生改变，389K乙酰化后不影响其与底物2-oxoglutarate的结合；Acadm，179K乙酰化后其与底物hexanoylCoA的结合改变；Hadha，728K乙酰化后其与底物2-trans-hexenoylCoA的结合改变；Hadh，81K乙酰化后其与底物3S-hydroxyhexanoylCoA结合改变；Acaa2，137K乙酰化后其与底物3-oxohexanoylCoA结合减弱。 研究结论： (1)长期有氧运动及Scriptaid给药均能显著增强有氧运动能力并改善骨骼肌葡萄糖耐量，缓解胰岛素抵抗； (2)长期有氧运动及Scriptaid均显著增强骨骼肌肌小节titin蛋白的乙酰化并能影响titin互作蛋白的乙酰化修饰； (3)长期有氧运动及Scriptaid给药均能显著影响骨骼肌糖、脂代谢通路中一些关键酶的乙酰化修饰水平，通过乙酰化修饰而改变其酶活性，从而影响该酶所催化的代谢过程并改善机体糖、脂代谢平衡。
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