摘要
随着胚胎工程技术的不断发展，卵母细胞成熟逐渐成为人们关注的热点，卵母细胞的质量直接影响着后续胚胎发育潜能。卵母细胞成熟包括核成熟和胞质成熟，胞质成熟主要是指通过mRNA和蛋白质的积累、细胞骨架和细胞器的重组、细胞代谢等一系列变化为受精和胚胎发育提供物质基础。TRIM28(KAP1/TIF1β)作为一种母源效应蛋白，在卵母细胞成熟过程中合成、储存，并在卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中起作用。因此，探究母源因子在卵母细胞成熟及早期胚胎发育中的作用及功能，对推动胚胎工程的发展及广泛应用具有重要的作用。为了研究母源效应因子TRIM28在牛卵母细胞成熟过程中的作用，本实验通过TRIM28基因克隆及过表达载体构建、细胞转染、荧光定量PCR和RNAi技术等分子生物学和胚胎工程技术，分析TRIM28过表达及下调对牛胎儿成纤维细胞表观遗传模式的影响，以及下调TRIM28后对卵母细胞胞质成熟的影响，主要得出以下结果： 1.成功构建了过表达载体pIRES2-EGFP-TRIM28； 2.我们合成了三条针对TRIM28的siRNA，通过筛选我们选择了将三条siRNA按1：1：1的比例混合转染牛胎儿成纤维细胞下调TRIM28，结果显示三条siRNA混合与单独的siRNA相比转染下调效率最高，下调率可达82.67%。 3.利用过表达载体pIRES2-EGFP-TRIM28，研究TRIM28过表达对牛胎儿成纤维细胞表观遗传模式的影响，我们将Lip3000与重组质粒pIRES2-EGFP-TRIM28转染牛胎儿成纤维细胞，转染48h后观察到约30%的牛胎儿成纤维细胞有荧光信号，转染72h后进行WesternBlotting分析显示TRIM28蛋白表达增加。荧光定量PCR结果显示，TRIM28在牛成纤维细胞中的表达显著增加(P＜0.01)，HP1BP3和DNMT1的表达减少(P＜0.05)，SETDB1表达增加，但不显著(P＞0.05)，多能基因TP53和抗氧化基因SOD在转染组表达增加，但差异不显著(P＞0.05)，促凋亡基因BAX的相对表达显著降低(P＜0.01)，通过研究在牛胎儿成纤维细胞中TRIM28过表达，结果显示促凋亡基因BAX的相对表达显著降低，表明TRIM28过表达抑制了细胞的凋亡； 4.利用RNAi技术，将Lip3000及三条混合siRNA转染牛胎儿成纤维细胞，研究下调TRIM28对牛胎儿成纤维细胞表观遗传模式的影响，对转染siRNA的牛胎儿成纤维细胞进行荧光观察，在镜下观察到紫外光激发细胞核染料呈蓝色，绿光激发二级抗体呈红色发光，免疫荧光染色观察到H3K9me3分布于细胞核内，TRIM28下调后，H3K9me3免疫荧光染色信号较对照组弱。荧光定量结果显示，转染组TRIM28的相对表达量明显低于对照组(P＜0.01)。与对照组相比，HP1BP3和DNMT转染组的相对表达量显著降低(P＜0.01)，SETDB1的表达没有明显变化，多能基因TP53和抗凋亡基因Bcl的相对表达量明显低于对照组(P＜0.01)，促凋亡基因BAX高于对照组(P＜0.01)，脂质代谢相关基因PPARA相对表达量显著高于对照组(P＜0.01)，抗氧化基因SOD(图2-5F)无明显差异(P＞0.05)。根据BAX和Bcl的表达，我们推测下调的TRIM28促进了细胞凋亡，抑制了细胞的生长。对于SOD，牛胎儿成纤维细胞下调TRIM28基因，对抗氧化剂并未造成显著影响。脂质代谢相关基因PPARA的相对表达量显著高于对照组，暗示下调TRIM28后可能影响了细胞脂代谢，从而阻滞了细胞发育进程。 5.利用显微注射技术将siRNA注射在GV期牛卵母细胞胞质中，研究下调TRIM28对牛卵母细胞胞质成熟的影响，利用体式显微镜统计牛卵母细胞成熟率，结果显示，正常组卵母细胞成熟率为80.7%±1.42，去除颗粒细胞但不注射组的卵母细胞成熟率为78.4%±1.37，NCsiRNA注射组的卵母细胞成熟率为78.1%±2.91，TRIM28下调组卵母细胞成熟率为75.32%±2.34。各组卵母细胞成熟率存在差异，但差异不显著。通过对各组卵母细胞装载ROS及线粒体荧光探针，并采集荧光信号分析，结果显示，下调TRIM28组ROS及线粒体荧光强度均低于NCsiRNA组，但差异不显著(P＞0.05)。荧光定量结果显示，NCsiRNA组BMP15的相对表达量较对照组低，但不显著(P＞0.05)，TRIM28下调组与对照组相比明显降低，差异显著(P＜0.05)。NCsiRNA组的GDF9的相对表达量较对照组低，但不显著(P＞0.05)，TRIM28下调组与对照组相比明显降低，差异显著(P＜0.05)。结果表明下调TRIM28后，影响了牛卵母细胞胞质成熟。
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