摘要
卡介苗(BCG)是一种预防结核病的减毒活疫苗，由于其安全性和成本优势，自诞生几十年来得到了广泛的应用。但随着时间的推移，BCG也暴露出免疫效力低、其保护性存在地区差异与年龄限制等众多缺点。而改良现有的BCG以增强其免疫效力是目前一个重要的研究方向。与结核分枝杆菌相比，BCG丢失了一段被称作RD区的基因序列，这段序列共分为16个区(RD1-RD16)，包含的部分基因与结核分枝杆菌的毒力和免疫原性有关。通过将免疫原性相关基因转化进BCG中，进而提高BCG的免疫效力，被认为是一种行之有效的策略。本研究以结核分枝杆菌H37Rv菌株中的RD-1区基因为模板扩增目的基因，构建重组pMV-261穿梭载体，利用电转化方法将重组载体导入感受态卡介苗中，纯化后共得到8种重组卡介苗。使用其中的rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875两种重组BCG与正常BCG分别侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞，观察细胞活性的变化及细胞中炎症相关因子的表达。然后利用LC-MS法分别检测BCG、rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875侵染的巨噬细胞与正常巨噬细胞中的脂类成分，并进行初步的代谢组学分析。在本研究中得到的结果如下： 1.成功构建pMV261-Rv3871、pMV261-Rv3872、pMV261-Rv3873、pMV261-Rv3874、pMV261-Rv3875、pMV261-Rv3877、pMV261-Rv3878与pMV261-Rv3879c共8种重组质粒。 2.通过电转化方法，将重组质粒转化进感受态卡介苗菌株中。成功构建出rBCG-Rv3871、rBCG-Rv3872、rBCG-Rv3873、rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875、rBCG-Rv3877、rBCG-Rv3878与rBCG-Rv3879c共8种重组卡介苗。并绘制其生长曲线，确定对数生长期与此时的活性细菌数量。 3.BCG、rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875对RAW264,7巨噬细胞的侵染能够抑制细胞的生长。rBCG-Rv3874、rBCG-Rv3875两种卡介苗对RAW264.7巨噬细胞的侵染能够上调细胞中促炎细胞因子的表达，提高细胞的凋亡水平，但其促炎作用低于卡介苗,而IFN-γ的表达则均呈下调趋势。 4.提取BCG、rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875侵染的RAW264,7巨噬细胞中的总脂质，利用LC-MS方法共检测出1450种成分。与未受侵染的RAW264.7细胞相比，BCG、rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875对巨噬细胞的侵染分别导致213、357、372种脂类成分出现显著变化。并进行初步的代谢组学分析，发现其中绝大部分物质为磷脂酰胆碱(PC)类成分，也有许多其他种类脂质成分发生变化。 本研究表明，与卡介苗相比，重组卡介苗rBCG-Rv3874与rBCG-Rv3875的侵染会对RAW264.7巨噬细胞产生更强烈的代谢变化，这些变化与Rv3874与Rv3875基因的导入有关。其中，rBCG-Rv3875侵染细胞所造成的变化要多于rBCG-Rv3874，说明RAW264.7巨噬细胞对Rv3875基因有着更强的应答。这对于研究结核分枝杆菌RD-1区基因的功能及重组卡介苗的筛选具有重要意义。
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