摘要
化学疗法简称化疗，是治疗癌症的主要有效手段之一，但同时也存在骨髓抑制等副作用。骨髓抑制限制了癌症的化疗效果，甚至会危及生命，控制骨髓抑制对于癌症的治疗具有重大意义。中药大部分属于天然药物，化学成分复杂，在治疗疾病方面具有多成分、多靶点的优势，近年来，人们越来越多的将中药用于骨髓抑制的治疗。人参、女贞子均为我国传统中药，人参大补元气，女贞子生精补髓，课题组成员高洪波主任医师在临床上将二者配伍用于骨髓抑制患者的治疗并取得了良好的疗效。虽然在临床已有应用，但中医尚未将人参、女贞子作为治疗骨髓抑制的常用药对，且二者配伍后化学成分的变化及药效研究尚未见文献报道，二者配伍治疗骨髓抑制的机理亦不明确。因此，本研究结合中医药理论，通过对人参、女贞子药对药效学的研究，证明二者配伍的合理性及优越性；在此基础上，进一步研究人参、女贞子配伍后化学成分的变化，应用网络药理学构建成分-靶点-通路网络，通过药理实验对其作用机制进行初步验证，旨在为骨髓抑制的治疗提供新的思路，并为将人参、女贞子作为治疗骨髓抑制的常用药对应用于临床提供实验及理论依据。主要研究内容如下： (1)通过连续三天腹腔注射环磷酰胺(100 mg/kg)建立小鼠化疗后骨髓抑制模型，采用血液学常规技术、造血祖细胞培养法、酶联免疫吸附法考察人参、女贞子配伍合煎液对骨髓抑制小鼠外周血中血细胞数、骨髓有核细胞数、造血祖细胞体外培养形成集落数及细胞集落刺激因子水平的影响。发现人参、女贞子合煎液可有效缓解小鼠骨髓抑制的症状，促进骨髓抑制小鼠外周血中血细胞及骨髓有核细胞数量的回升、提高造血祖细胞分化的能力、调节血清中细胞集落刺激因子水平、使萎缩的胸腺和肿大的脾脏趋于正常。人参、女贞子配伍对小鼠骨髓抑制具有显著的保护作用，证实了中医临床观察的结果。 (2)基于中医基础理论，将人参、女贞子配伍与单味药药效进行比较，发现二者合煎液对小鼠骨髓抑制的保护作用优于单煎液，证明人参、女贞子配伍符合遣药组方规则、药效增强。另一方面，将人参、女贞子配伍与加量的单味药药效进行比较，进一步证明增加单味药的用量并不能达到与配伍相同的药效，配伍的优势在于二者的相互作用，而非单纯的药量增加。揭示了将补气药人参与补阴药女贞子配伍使用后药效增强，可能是缘于二者“1+1＞2”的“协同作用”。 (3)采用醇沉糖结合大孔吸附树脂柱层析对人参、女贞子合煎液及单煎液进行了粗分离，得到合煎液及单煎液多糖部位、大孔树脂水洗部位、大孔树脂醇洗部位。通过检测骨髓抑制小鼠外周血细胞数量、骨髓有核细胞数等指标比较了9个不同部位对小鼠骨髓抑制保护作用的影响。结果表明，合煎液的大孔树脂醇洗部位及多糖部位对小鼠骨髓抑制保护作用优于单煎液对应的部位，大孔树脂水洗部位对小鼠骨髓抑制保护作用不明显。研究结果进一步佐证了配伍的优越性。 (4)通过比较人参、女贞子配伍与单味药中16种人参皂苷含量、女贞子三种有效成分含量以及多糖中单糖组成比例的变化，发现人参、女贞子配伍后化学成分不是两单味药化学成分的简单相加，而是发生了相应的转化。人参、女贞子配伍后常见人参皂苷向稀有人参皂苷转化，且转化率较高：配伍后常见人参皂苷含量由总含量的86.55%降低至29.14%，而稀有人参皂苷含量由13.45%升高至70.86%，其中人参皂苷Rg5含量达到最高；配伍后女贞子三种主要成分(红景天苷、酪醇、特女贞苷)含量有所降低，但特女贞苷绝对含量仍较高；配伍后多糖中单糖组成比例发生了明显变化。化学成分的转化可能是人参、女贞子配伍后药效增强的直接原因。 (5)将化学成分检测结果与中药系统药理学技术平台(TCMSP)相结合，筛选出21个主要成分。通过数据库及分析平台预测，分别获取成分潜在作用靶点73个、骨髓抑制相关作用靶点100个，从中筛选出核心靶点共56个，并进一步进行GO和KEGG通路富集分析。经KEGG通路及通路间关联性分析，发现有5条通路与骨髓细胞的增殖、分化以及凋亡有很大的联系，且这5条通路都与MAPK通路有较高关联。经GO富集分析，推断核心靶点主要存在于线粒体、胞质、纺锤体，分子功能是蛋白结合、ATP结合，极有可能参与细胞分裂、细胞凋亡过程的调控。 (6)基于网络药理学的预测结果，考察了人参、女贞子配伍对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期的影响，发现人参、女贞子合煎液可使小鼠G0/G1期细胞比例显著降低，使更多细胞进入S期进行DNA合成，继而进入G2/M期，完成有丝分裂过程。相关蛋白表达研究表明，人参、女贞子配伍可能通过促进MEK和p-ERK蛋白的表达使受损的DNA修复并进入正常的增殖周期；通过调节Bcl-2/Bax的平衡以及抑制Caspase-3蛋白的表达使骨髓细胞避免启动凋亡以补充外周血中减少的血细胞。 (7)化学及药理实验表明，化学成分的变化可能是导致药理活性增强的主要原因。本实验进一步研究了人参、女贞子配伍后三种主要成分(人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk3以及特女贞苷)对小鼠骨髓抑制的保护作用。研究结果表明，三种成分均能有效增加骨髓抑制小鼠的外周血细胞及骨髓有核细胞数、调节血清中细胞集落刺激因子水平、促进MEK、p-ERK蛋白的表达、使造血祖细胞进入正常细胞周期实现细胞的增殖。基于实验结果推测，人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk3以及特女贞苷可能是人参-女贞子合煎液对小鼠骨髓抑制保护作用的主要有效成分。 本实验研究发现，人参、女贞子配伍后化学成分发生明显变化，人参中稀有人参皂苷比例显著增加，同时对小鼠骨髓抑制的保护作用明显增强，化学成分的变化有可能是人参、女贞子配伍实现协同增效的本质原因。基于网络药理学通过动物实验验证了人参、女贞子配伍对小鼠骨髓抑制保护的作用机制。补气药人参与补阴药女贞子配伍实现了增效的目的、符合中医药遣药组方的规则，有望作为常用药对用于临床上骨髓抑制的治疗。
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