摘要
菜心(Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)为十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，以菜薹为主要食用器官，可周年生产，是华南地区栽培面积和产量最大的蔬菜。携带AA基因型的白菜类作物属于芸薹属再生率比较低的类型，其不定芽再生困难，农杆菌不易感染且侵染后细胞不易分化，影响了基因工程在白菜类品种改良上的应用。随着全基因组测序计划的完成，白菜已经成为研究十字花科植物功能基因组的模式植物。高频再生体系是基因功能研究的基础，遗传转化体系的建立将为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。 本文以菜心为材料，研究了不同苗龄、外植体类型、6-BA与NAA比值、渗透压、琼脂浓度、AgNO3浓度等对不定芽再生率的影响，建立并优化了菜心高频再生体系。利用农杆菌介导法进行侵染，分别对预培养时间、共培养时间、侵染时间、侵染浓度、选择压及是否添加活性添加剂等菜心遗传转化的影响因子进行探究，建立了菜心遗传转化体系。主要研究结果如下： 1.建立并优化了菜心高频再生体系。选择3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，以MS为基础培养基，最佳分化培养基为：MS+0.3mg/LNAA+5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+2mg/LAgNO3，外植体再生率达86.67%；选择长势良好的不定芽进行生根培养，最佳生根培养基配方为：MS+0.3mg/LNAA+30g/L蔗糖+12g/L琼脂+5mg/LAgNO3，生根率为73.33%。 2.建立了菜心遗传转化体系。构建超表达载体pCAMBIA3301-BcAMT1.2。选择3d苗龄的菜心无菌幼苗的带柄子叶为外植体，预培养3d，用OD600=0.5-0.6的农杆菌菌液侵染10min，迅速转移至共培养培养基，共培养2d后进行恢复培养。不定芽长至1.5cm左右进行筛选培养，选择压为55.6μL/L的PPT，继代培养2-3次，选择筛选后正常生长的不定芽进行生根培养。不定根生长健壮时开瓶炼苗3-7d即可移栽。 3.转基因植株的初步鉴定。对炼苗成功的菜心植株经PCR鉴定和GUS染色分析，90个外植体，共获得2棵转基因菜心苗，转化率为2.22%。 综上，本试验成功建立菜心高频再生体系，再生率为86.67%；利用农杆菌介导法建立了菜心的遗传转化体系，转化率为2.22%。
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