摘要
【目的】 1.研究载脂蛋白E(APOE)基因多态性与脓毒症的发生是否相关。 2.研究APOE基因多态性与脓毒症亚组之间的关系，分析其与脓毒症进展是否相关。 3.研究脓毒症状态下APOE的表达水平。 4.观察APOE在脓毒症炎症反应中的作用。 5.研究APOE基因多态性在APOEmRNA和蛋白水平是否存在差异。 6.揭示APOE基因多态性与其下游促炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平的相关关系。 【方法】 收集脓毒症患者及健康体检者血液标本，采用RFLP法对APOE基因进行基因分型，使用SPSS21.0和GraphPadPrism6.0统计软件分析APOE基因型的分布，研究APOE基因型与脓毒症发病风险的关联性；根据2016年国际脓毒症会议制定的指南将脓毒症患者分为脓毒症组和脓毒症休克两个亚组，比较APOE不同基因型在两组的分布情况，分析APOE基因型与脓毒症的进展之间的相关关系；根据发病28天内患者的生存状况，将患者分为生存组和死亡组，通过分析不同APOE基因型患者28天生存情况，研究APOE不同基因型与患者预后之间的相关关系。使用实时荧光定量PCR法检测随机抽取的脓毒症病例和健康对照组病例的外周血单核细胞APOEmRNA表达水平，用酶联免疫吸附实验检测外周血单核细胞APOE蛋白以及TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平。通过健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)和Raw264.7细胞系的培养，分别给予脂多糖(LPS)刺激，检测APOEmRNA、APOE蛋白以及细胞培养上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达水平，分析在LPS刺激下APOEmRNA、蛋白与下游的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的变化；同时在动物水平采用野生型(WT)和APOE-/-(APOE敲除)小鼠腹腔注射LPS，检测两组小鼠血清炎症因子表达水平和生存情况。对健康志愿者和脓毒症患者以及提取的PBMC进行基因分型，分析不同APOE基因型与APOEmRNA、APOE蛋白、TNF-α、IL-6、IL-1β之间的相关关系。 【结果】 1.APOE基因型与脓毒症的进展相关。 收集来自湛江、武汉、哈尔滨三所教学医院共699例健康对照者和601例脓毒症患者纳入本研究。结果发现在健康志愿者和脓毒症患者中APOE基因型没有显著统计学差异(P＞0.05)。脓毒症亚组分析显示，脓毒症组患者APOEE3/3基因型分布频率显著高于脓毒症休克组(P=0.013)，而脓毒症休克患者APOEE2/4基因型分布频率显著高于脓毒症组(P=0.017)，同时脓毒症休克组APOE4+基因型分布频率显著高于脓毒症组(P=0.031)。 2.APOE基因多态与脓毒症的预后相关。 APOE4-和APOE4+基因型在28天生存组的频数分别为382(78.9%)和82(70.1%)，28天内死亡组频数分别为102(21.1%)和35(29.9%)，生存组和死亡组比较有统计学差异(P=0.041)；生存分析显示APOE4+基因型的28天生存情况比APOE4-的差，log-ranktest5.073,(P=0.024)。 3.APOE在脓毒症状态下展现出一定保护作用。 在脓毒症状态下APOE表达水平下降，但是炎症因子的表达水平升高。与健康志愿者相比，脓毒症患者的APOEmRNA和蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05)，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平显著升高；在健康志愿者PBMC加入LPS后APOEmRNA和蛋白水平显著下降(分别为P=0.02和P＜0.01)，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平显著升高(P＜0.05)；Raw264.7细胞经LPS刺激后，APOEmRNA和蛋白水平显著下降(P＜0.05)，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平也显著升高。Raw264.7细胞先LPS刺激然后再加入APOE蛋白，与单独加入LPS组比较，上清液IL-6表达水平显著下降(P=0.03)。动物实验显示，APOE敲除(APOE-/-)小鼠脓毒症模型的死亡率为100%，而野生型(C57)小鼠的死亡率为71%，APOE-/-小鼠表现出死亡率增加的趋势，但是没有统计学意义，log-ranktest0.84,(P=0.36)，同时发现APOE-/-小鼠的血清炎症因子表达水平显著高于C57小鼠(P＜0.05)。 4.APOE4-蛋白具有抗炎作用。 根据基因型将健康对照组和脓毒症患者分为APOE4-和APOE4+两种基因型组，在健康对照组中APOE4-和APOE4+基因型的APOEmRNA的表达水平上没有显著统计学差异(P=0.15),脓毒症患者中APOE4-和APOE4+基因型的APOEmRNA的表达水平上也没有显著统计学差异(P=0.44),在健康对照组和脓毒症患者中APOE4-和APOE4+组在APOEmRNA的表达水平上也没有显著统计学差异(P＞0.05)，但是APOE4-基因型的脓毒症患者APOE蛋白的表达水平比APOE4-基因型健康对照组的APOE蛋白水平低(P＜0.01)。在PBMC中LPS刺激后不同基因型的APOEmRNA与对照组比较没有统计学差异(P＞0.05)，在LPS组中APOE4+组的蛋白水平高于APOE4-组(P＜0.01)，对照组中APOE4+和APOE4-的APOE蛋白水平没有统计学意义(P＞0.05)，APOE4-基因型在LPS刺激下APOE蛋白的表达水平显著降低(P＜0.01)。 5.APOE4+基因型能增强炎症反应。 对照组的APOE4-和APOE4+基因型在炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β中没有差异，脓毒症患者中APOE4+基因型的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平高于APOE4-基因型(P＜0.05)；PBMC中APOE4-和APOE4+基因型在对照组中没有统计学差异，PBMC在LPS刺激后APOE4+基因型的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平明显高于APOE4-基因型(P＜0.05)。 【结论】 1.APOE基因多态性与脓毒症发病风险无关； 2.APOE基因型中APOE4+基因型与脓毒症病情发展风险显著相关； 3.APOE基因型中APOE4+基因型与脓毒症的临床预后相关； 4.在脓毒症状态下APOE发挥保护作用； 5.APOE发挥保护作用的机制可能与APOE4-基因型蛋白消耗有关。
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