摘要
【目的】 1.探索治疗急性心肌梗死的最佳移植物组合。 2.验证红景天苷复合水凝胶承载rASCs的生物特性及安全性。 3.探索红景天苷复合水凝胶承载过rASCs对氧化应激状态下心肌细胞的保护作用及机制。 4.探讨复合水凝胶携带rASCs改善急性心肌梗死心肌损伤的作用机制。 【方法】 1.体外SAL浓度筛选分为5组:对照组(NC)、模型组(H2O2)、实验组(低中高SAL浓度组)；SAL复合水凝胶携带过表达miR-1的rASCs与H9C2共培养实验分为7组:正常对照组(NC)、单纯水凝胶+rASCs模型组(rASCs+Gel)、SAL复合水凝胶+rASCs模型组(rASCs+SAL-Gel)、单纯水凝胶+过表达miR-1rASCs实验组(miR-1+Gel)、SAL复合水凝胶+过表达miR-1rASCs实验组(miR-1+SAL-Gel)，单纯水凝胶模型组(Gel)、SAL复合水凝胶模型组(SAL-Gel))；动物实验分组分为8组:正常对照组(NC)、心梗模型组(MI)、单纯水凝胶心梗组(Gel)、SAL复合水凝胶心梗组(SAL-Gel)、单纯水凝胶+rASCs心梗组(rASCs+Gel)、SAL复合水凝胶+rASCs心梗组(rSASCs+SAL-Gel)、单纯水凝胶+过表达miR-1rASCs心梗组(miR-1+Gel)、SAL复合水凝胶+过表达miR-1rASCs心梗组(miR-1+SAL-Gel)；裸鼠致瘤性实验分组共3组:生理盐水组(NS)、rASCs+SAL-Gel组(rASCs+SAL-Gel)、HeLa细胞组(HeLa)。 2.制备SAL复合水凝胶，扫描电子显微镜观察水凝胶三维形态，将rASCs与复合水凝胶共培养，观察细胞的生存情况； 3.给予不同浓度SAL配制复合水凝胶，通过CM-Dildye染色观察0、1、3、7天细胞的生长存活情况，筛选最佳的SAL配制浓度。 4.miR-1过表达慢病毒转染rASCs，构建体外H9C2氧化应激损伤模型，通过CCK-8、LDH、TUNEL、PI/Hoechst33342、AnnexinV-FITC/PI、WesternBlot检测方法，探索体外构建SAL复合水凝胶移植rASCs抗氧化应激中的作用及相关机制。 5.建立SD大鼠心肌梗死模型，将水凝胶和rASCs混合物注射于大鼠心肌心外膜下，通过HE染色、TUNEL染色、Masson染色、小动物活体成像、小动物超声、激光多普勒表面血流灌注方法观察大鼠心肌梗死后的修复效果。 6.裸鼠左侧腋下注射SAL复合水凝胶，通过体表观察和HE染色检测复合水凝胶的安全性。 【结果】 1.qRT-PCR结果验证，miR-1过表达慢病毒转染组(miR-1-LV)的miR-1-3p和miR-1-5p表达水平较阴性对照组(control-LV)分别升高了65.6倍和37.4倍。 2.扫描电镜观察到SAL加入水凝胶后不影响水凝胶的三维空间结构。 3.CCK-8和LDH结果显示，常规培养条件下SAL复合水凝胶不影响rASCs的细胞活性。 4.CM-DilDye标记rASCs发现，用100μmol/L终浓度的SAL制备复合水凝胶对抗氧化应激损伤的效果最佳。 5.CM-DilDye标记rASCs的三维成像显示，细胞接种至水凝胶后逐渐体积增大且呈分支状、集落生长。 6.H9C2的细胞活力和LDH释放水平显示SAL复合水凝胶和单纯水凝胶均能改善H9C2细胞氧化应激损伤，但随着时间延长可观察到miR-1+SAL-Gel保护效果增强。 7.TTC染色证实SD大鼠心梗造模成功，可看见明显梗死灶。 8.心脏超声结果显示：与正常组比较，心肌梗死造模后，模型组和各处理组大鼠心脏的射血分数和左心室缩短分数均降低，差异有统计学意义；与模型组比较，各处理组均有改善，差异有统计学意义。其中miR-1过表达的rASCs与SAL复合水凝胶注射组的心功能改善最明显。 9.SAL复合水凝胶承载过表达miR-1干细胞可改善心梗后表面血流灌注量。 10.体内注射承载rASCs的SAL复合水凝胶，NS组和rASCs+SAL-Gel组体重无明显变化，而HeLa组从第7天逐渐发现肿块。HE染色检测NS组和rASCs+SAL-Gel组肌肉组织细胞排列规则，核质比正常。而HeLa组出现明显癌细胞巣块，且发现癌细胞浸润周围肌肉组织，使肌肉纹理改变。 11.小动物活体成像观察到SAL复合水凝胶承载的rASCs在体内滞留时间比单纯注射rASCs时间更长。 【结论】 1.SAL复合水凝胶承载过表达miR-1的rASCs对心肌梗死心肌损伤的修复效果最佳,这可能是通过心肌细胞凋亡起作用。 2.SAL复合水凝胶体外rASCs培养对rASCs无细胞毒性，体内rASCs移植无致瘤型，是一种相对安全的干细胞载体。 3.rASCs包埋于SAL复合水凝胶可增加其在体内的滞留能力。
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