摘要
在制备转基因动物时常利用标记基因对转基因动物进行筛选和鉴定，但标记基因整合至转基因动物基因组可能会产生潜在的安全隐患，使转基因动物的安全评价过程变得复杂，直接影响了转基因动物的推广和产业化进程；养猪业中抗生素的长期滥用和误用，是导致细菌耐药性增加、猪肉产品中药物残留以及食品安全风险增加的重要原因。 本研究利用Cre/LoxP系统对本课题组前期制备的抗PCV2转基因猪的标记基因进行删除，制备出无标记基因的抗PCV2转基因猪；构建共表达PR39和PG1双抗菌肽基因的真核表达载体pCMS-PR39-T2A-PG1-EGFP，经体外细胞功能验证，采用原核显微注射生产F0代转基因小鼠，筛选稳定遗传和高表达PR39和PG1抗菌肽基因的F0代小鼠扩繁，最后用F1代转基因小鼠进行攻毒验证PR39和PG1抗菌肽的抗菌功能；将共表达PR39和PG1双抗菌肽真核表达载体pCMS-PR39-T2A-PG1-EGFP电转染导入无标记基因的抗PCV2转基因猪耳皮成纤维细胞中，制备既能抗PCV2又能抗菌的转基因猪耳皮成纤维细胞系。 本文的主要研究结果如下： 1.整合到F0代抗PCV2转基因克隆猪基因组中的外源基因能稳定遗传到F1代，整合位点分布于5条不同的染色体上；F1代转基因猪个体间携带的外源基因拷贝数和在基因组中的整合位置不同，外源基因表达量存在差异。成功建立携带单拷贝外源基因的F1代抗PCV2转基因猪耳皮成纤维细胞系。成功表达并纯化得到纯度为95%，浓度为0.6mg/mL，总计1.2mg，有活性的HTNCre重组蛋白。利用HTNCre重组酶成功删除F1代抗PCV2转基因猪的耳皮成纤维细胞系的标记基因，删除效率为95%，筛选得到多个无标记基因的细胞单克隆。通过体细胞克隆成功获得一头存活的无标记基因的抗PCV2转基因猪。 2.成功构建共表达PR39和PG1抗菌肽的真核表达载体pCMS-PR39-T2A-PG1-EGFP。共表达载体能在293细胞中正常高效表达PR39和PG1抗菌肽mRNA和蛋白质。共表达载体转染293细胞后在细胞上清以及细胞中所表达的PR39和PG1抗菌肽具有显著抑制大肠杆菌的生物活性。 3.通过原核显微注射法成功制备了9只共表达PR39和PG1抗菌肽基因的F0代转基因小鼠，其中8号和23号F0代转基因小鼠的绿色荧光蛋白标记基因以及PR39和PG1抗菌肽基因的表达量相对较高。23号F0代转基因小鼠能稳定将外源基因遗传至F1代转基因小鼠，PR39和PG1抗菌肽基因在转基因小鼠的多个组织中高效稳定表达，外源基因的整合并不影响转基因小鼠的生长性能。猪胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠后8h、12h、16h，转基因小鼠的存活率分别为72.00%、56.00%、48.00%，均极显著高于同时间点的同窝非转基因小鼠的存活率，其分别为33.33%、16.67%、0.00%，表明PR39和PG1抗菌肽可增强转基因小鼠的抗菌能力，提高其存活率。猪胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠4h后，存活转基因小鼠的心、肝、脾、肺组织细菌含量均显著低于同窝非转基因小鼠，且组织病理症状也比同窝非转基因小鼠轻，与未感染组症状基本一致。猪胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠后，在4h~16h死亡的转基因小鼠各组织含菌量均极显著高于同窝非转基因小鼠，且组织病理症状较同窝非转基因小鼠严重，表明共表达PR39和PG1转基因小鼠对细菌具有更强的耐受力，在死亡之前能承受更高剂量的细菌。 4．通过优化细胞电转染条件，成功将共表达载体pCMS-PR39-T2A-PG1-EGFP导入无标记抗PCV2转基因猪耳皮成纤维细胞中，转染效率为60.4%。通过单克隆筛选，成功获得19个整合PR39和PG1双抗菌肽基因的抗PCV2转基因猪耳皮成纤维单细胞克隆团，为后续利用体细胞克隆法制备既能抗PCV2又能抗菌的转基因猪提供基础。
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