摘要
龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是南亚热带地区重要的常绿经济果树。然而龙眼喜温忌冻，温度一直是限制龙眼地理分布的主要因素，周期性的低温霜冻对龙眼产业造成严重的经济损失。除此之外，我国龙眼的主栽品种成熟期过于集中，且保鲜难度大，季节性供过于求的情况严重，导致销售困难，经济效益低。而解决以上两大产业问题的有效途径是选育抗寒优质的龙眼新品种，这不仅可以减轻低温对龙眼的伤害，而且结合适度的北移栽培，可以延长龙眼的成熟期，减缓鲜果集中上市所造成的销售压力。然而，目前对龙眼抗寒相关的分子机制尚不明了，限制了龙眼抗寒育种的进程。因此，本研究通过转录组分析和基因同源比对的方法，筛选与龙眼抗寒相关的MYB基因，解析其在低温响应中的功能特性及调控机制，以期为龙眼抗寒育种提供理论依据。本研究主要结果如下： 1、通过转录组分析和基因同源比对，筛选到8个与抗寒相关MYB同源的蛋白，从中选取5个同源蛋白的基因进行低温表达模式分析，其中DlMYB13-1、DlMYB13-2、DlMYB2、DlMYB73的表达量在低温处理后呈现先升后降的趋势，但它们响应低温的时间存在差异，DlMYB2、DlMYB73响应最快，表达量在处理6h后即出现显著上升，而DlMYB13-1、DlMYB13-2的表达量在处理24h后开始上升，4个基因的表达量均在处理36h后达到最高，然后开始下降。DlMYB3R-2的表达量从低温处理6h后呈持续上升趋势，直至处理48h后。 2、对DlMYB13-1、DlMYB13-2、DlMYB2、DlMYB73和DlMYB3R-2进行基因克隆，其开放阅读框(Open Reding Frame，ORF)全长分别为807、852、939、735和1722bp，分别编码268、283、312、244和573个氨基酸。序列分析表明DlMYB13-1、DlMYB13-2、DlMYB2、DlMYB73为R2R3型MYB转录因子，DlMYB3R-2为R1R2R3型MYB转录因子，其中DlMYB13-1与DlMYB13-2的核苷酸序列同源性为62.72%。系统进化分析显示DlMYB13-1、DlMYB13-2、DlMYB2、DlMYB73和DlMYB3R-2分别与枳(Poncirus trifoliata)PtrMYB15、葡萄(Vitis vinifera)VvMYB14、VvMYB108、克里曼丁橘(Citrus clementina)CcMYB77和CcMYB3R-5的亲缘关系较近。 3、亚细胞定位表明DlMYB13-1、DlMYB13-2、DlMYB2、DlMYB73和DlMYB3R-2均定位于细胞核中。在酵母系统中，DlMYB13-1、DlMYB13-2和DlMYB2具有转录激活活性，而DlMYB73和DlMYB3R-2无转录激活活性。 4、启动子分析表明，DlCBF1/2/3启动子上除了存在多个光、胁迫及激素响应相关的顺式作用元件，还包含大量MYB结合元件。酵母单杂交和双荧光素酶实验结果表明，DlMYB13-1和DlMYB13-2均能结合DlCBF2和DlCBF3的启动子，并表现出抑制效应，说明DlMYB13-1和DlMYB13-2可能负调控DlCBF2和DlCBF3基因的表达。 5、超表达DlMYB13-2的拟南芥植株抗冻能力弱于野生型拟南芥，低温处理后超表达DlMYB13-2拟南芥的脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥，而H2O2和MDA含量则显著高于野生型，表明在拟南芥中超表达DlMYB13-2会减弱植株的抗寒性，推测DlMYB13-2是龙眼低温响应中的负调控因子。
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